Name: simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
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Die Autoren erkennen COST Action CM1406 (epigenetische chemische Biologie). Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der Stiftung Pierre Mercier unterstützt.

(1) Zellkultur
Hinweis: Die folgenden Schritte sind in einem standard Gewebekultur Abzug durchgeführt. Vertrautheit mit steriler Technik wird erwartet.
<ol>
	<li>Kultur von HeLa-Zellen zu 80 % Konfluenz in einem T75 Zelle Kultur Kolben in MEM ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin G (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/mL). Hinweis: Zelle Kultur, Behandlung und Lyse Schritte erfolgen unter Laminar-Flow mit Zelle Inkubation bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre des 5 % CO2 unter sterilen Bedingungen durchgeführt.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL des DPBS, aspirieren Sie des DPBS und fügen Sie 1 mL der Zelle Dissoziation Reagenz. Inkubation bei 37 ° C für 5 min um die Zellen zu lösen.</li>
	<li>9 mL Kulturmedium MEM hinzufügen, gründlich Aufschwemmen der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Passen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 6 x 104 Zellen/mL in MEM.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL Zellsuspension Steuerelement hinzu und testen Sie die Brunnen von einem sterilen, flach-Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte (Abbildung 1A).</li>
	<li>Leere Brunnen von 96-Well-Platte (Abbildung 1A) 100 µL MEM Kulturmedium hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 24 h. Hinweis: Eine 24 h Inkubation ist eine passende Zeit für endogene HDAC-Aktivität in HeLa-Zellen zu testen. Verschiedene Zelltypen mit unbekannten HDAC-Aktivität können eine Timecourse Bewertung der Kontrollzellen benötigen.</li>
</ol>
2. Behandlung mit Testverbindungen und HDAC Substrate
<ol>
	<li>Aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Hinzufügen von 25 µL 2 x Testverbindungen (z. B. Trichostatin A, MS275 und Tubastatin A) in MEM, Brunnen zu testen. Kontrolle und leeren Brunnen 25 µL MEM hinzufügen. Hinweis: Die Konzentration der Testverbindungen soll eingestellt werden, um eine Reihe von mindestens 5 Abschlusstest Konzentrationen (eine Konzentration pro Well) bieten. Die Endkonzentration von DMSO in der Testverbindung sollte sollte nicht mehr als 0,5 % und in jede Vertiefung, einschließlich Leerzeichen und Kontrollen. Die endgültige Inkubation beträgt 50 µL pro Bohrloch. Trichostatin A wird getestet, bei 5 Konzentrationen von 500 bis 1,95 nM (Verdünnung 1:4). MS275 und Tubastatin A sind bei 5 Konzentrationen von 8.000 bis hin zu 6.17 getestet nM (Verdünnung 1:6). Die gewünschte Abschlusstest Konzentration für jedes Testverbindung sollte von jedem einzelnen Benutzer bestimmt werden, durch die Schaffung einer Dosis-Wirkungs-Kurve.</li>
	<li>Prüf- und Testanlagen Brunnen 25 µL der Substratmischung (42 µM MAL 42 µM MOCPAC und 42 µM BATCP in MEM) hinzufügen. Leere Brunnen 25 µL MEM hinzufügen. Hinweis: Die Endkonzentration von jedem Substrat ist 21 µM. MOCPAC und BATCP unterscheiden zwischen HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit, bzw. (Abbildung 1 b). Wenn keine Aktivitäten mit diesen Substraten beobachtet wird, kann die Verwendung von MAL möglicherweise zur Identifizierung der Aktivität gegen eine weitere HDAC-Isoform führen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 8 h in einer befeuchteten 5 % CO2 Inkubator. Hinweis: Diese Inkubationszeit eignet sich für HeLa-Zellen und ermöglicht die endogenen HDAC zur Interaktion mit der synthetische Substrate. Verschiedenen Zelllinien erfordern Anpassungen im Inkubation Zeit und/oder Substrat Konzentration.</li>
</ol>
(3) Zell-Lyse und Probenvorbereitung für UHPLC-ESI-MS/MS
Achtung: Die Probe Vorbereitungsschritte verwenden organische Chemikalien, die leicht entzündlich und giftig durch Verschlucken oder einatmen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.
<ol>
	<li>Fügen Sie 10 µL 6 X RIPA Puffer (aus 10 X RIPA-Puffer verdünnt) mit Protease-Inhibitor in jede Vertiefung der 96-Well-Platte ergänzt.</li>
	<li>Stoppen der Reaktions durch Zugabe von 160 µL kalter Acetonitril in jede Vertiefung und Mischen von Pipettieren rauf und runter. Hinweis: Bewahren Sie die Acetonitril bei-20 ° C vor diesem Schritt.</li>
	<li>Platzieren Sie die Platte in einer Gefriertruhe-80 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Gefrierschrank und übertragen Sie 220 µL des Inhalts der einzelnen Brunnen auf eine unsteril, konischen Boden (V-Boden) 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 5.000 x g und 4 ° C für 10 min. Hinweis: Dieser Schritt zielt auf Proteine und Salze zu entfernen. Bei Bedarf können die Lösungen in einzelnen konischen Zentrifuge Rohre vor Zentrifugation übertragen oder gefiltert durch eine Reihe von 96-Well, 0,65 µm PVDF Filterplatten. Die Abwahl des Niederschlags ist vor der UHPLC-Analyse erforderlich.</li>
	<li>200 µL des Überstandes (oder Filtrat) in eine 96-Well-Platte mit dem UHPLC-System kompatibel und mit schweißtechnischen, abziehbare Folie mit einer Platte Versiegelung versiegeln. Hinweis: Vermeiden Sie die Pellets pipettieren, wenn Sie die Überstände entfernen. Wenn die UHPLC-Analyse sofort durchgeführt werden kann, kann die Platte bis zur Analyse bei 4 ° C für maximal 24 Stunden gespeichert.</li>
</ol>
4. UHPLC/MS-MS-Analyse
<ol>
	<li>Bereiten Sie das UHPLC-System, indem es mit der mobilen Phase System (95 % A:5 % B): A: H2O, HPLC-Klasse, mit 0,1 % Ameisensäure (bereiten Sie 1 L) B: Acetonitril, HPLC-Grade, mit 0,1 % Ameisensäure (bereiten Sie 1 L). Vorsicht: Die mobile Phase enthält organische Chemikalien, die leicht entzündlich und giftig durch Verschlucken oder einatmen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.</li>
	<li>Platz 96-Well-Platte in der Beispiel-Manager enthält eine Kennzeichenhalter. Führen Sie die Proben nach Maßgabe UHPLC-ESI-MS/MS in Tabelle 1. Hinweis: Jede Spalte der analytischen 96-Well-Platte sollte auch eine Kontrolle und eine leere haben (wie dargestellt in das Platte-Schema der Abbildung 1A). Steuerelemente sind repräsentativ für 100 % enzymatische Aktivität in der getesteten Zell-Linie, während Rohlinge gibt es zu prüfen, ob die MS Quelle einheitlichen Hintergrund leistet. Ungewöhnliche MS Gipfeln in einem bestimmten Rohling erkannt sollte untersucht werden, um MS Empfindlichkeit Änderungen zu verhindern.</li>
</ol>
(5) Datenanalyse
<ol>
	<li>Die Peakfläche jedes Substrat und ihrer deacetylated Produkte mit einem entsprechenden UHPLC-Integrations-Software zu integrieren. Hinweis: Verwenden Sie automatische Integration Parameter mit einem Glättungsverfahren (Mittelwert, Fenstergröße 3 und Anzahl von zum Beispiel 2, glatt). Mit den chromatographischen Bedingungen in Tabelle 1ist die Elution Reihenfolge dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) und BATCP (9,8 min), wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Berechnen Sie für jedes Substrat die Peak-Flächenverhältnis (deacetylated/acetyliert) in jedem Chromatogramm (Prüf-, Steuer- und Proben).</li>
	<li>Berechnen Sie die prozentuale HDAC Hemmung von jeder Probe: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg"> Hinweis: HDAC1 Hemmung wird anhand der Peak-Flächenverhältnis von dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 Hemmung wird mit dBATCP/BATCP berechnet. Die Verhältnis dMAL/MAL kann verwendet werden, allgemeine HDAC Hemmung zum Ausdruck bringen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+protein+families:+a+new+frontier+for+drug+discovery.">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li><li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+cellular+memory+and+gene+regulation.">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress.">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+p53+at+lysine+373/382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21(Waf1/Cip1).">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+in+transcriptional+regulation.">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li><li>Sim&#245;es-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases:+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs?.">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?.</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. 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Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012)</li><li>. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013)</li><li>. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015)</li><li>Yee, A. 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L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases.">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

HDAC-Hemmung ist ein heißes Thema in der Drogeentdeckung, mit dem aktuellen Fokus auf HDAC6-selektive Inhibitoren für Krebs-Therapie-21. HDAC Selektivität bemisst sich in der Regel durch eine Reihe von hohem Durchsatz, zellfreie Assays, die beabsichtigen, die inhibitorische Potenz gegenüber einzelnen HDAC Isoformen21bestimmen. Jedoch die Selektivität der Inhibitor muss zusätzlich bestätigt werden in lebenden Zellen durch die Auswertung des Acetylierung Status des end...

HDACs gehören zu einer Familie von Enzymen in der Lage, die Histone innerhalb der Chromatinstruktur deacetylate. Sie haben andere Protein-Substrate in der Zellflüssigkeit und befinden sich in verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Insgesamt 18 HDAC-Isoformen wurden bisher identifiziert und haben wurde im Zusammenhang mit mehreren Zellmechanismen, einschließlich der Regulierung von Transkriptionsfaktoren und Genexpression sowie Zelle signalisieren und1,2,3,4,5,6,7. Katalytische HDAC-Inhibitoren haben als mögliche therapeutische Medikamente für die Krebstherapie entwickelt. Die meisten HDAC-Inhibitoren derzeit von der FDA zugelassen sind für die Behandlung von T-Zell-Lymphom und Multiples Myelom, und unspezifische HDAC-Inhibitoren, wie z. B. Vorinostat (SAHA), Belinostat und Panobinostat8,9. Jedoch eine Reihe von Nebenwirkungen wurden im Zusammenhang mit Pan-Hemmer, und die Suche nach Isoform-spezifische kleine Moleküle ist ein heißes Thema in der medizinischen Chemie und Drug Discovery. Entsprechend der Klasse ich (HDAC1-3 und HDAC8) selektiver Hemmstoff-Romidepsin ist ein bereits zugelassenes Medikament10, während HDAC6-spezifische Inhibitoren derzeit in klinischen Studien mit erhöhten therapeutisches Potenzial in multiplen Myeloms11,12,13,14,15sind.
Screening-Tests zur Charakterisierung von HDAC Inhibitoren die Inkubation von einem HDAC-Substrat mit einer enzymatischen Quelle (einzelne Isoform, nukleare Extrakt oder Zelle lysate) basieren. Das Substrat ist in der Regel eine kleine Peptidsequenz eine Acetyl Lysin Rückstände mit einem spaltbaren Fluorophor (z. B. Cumarin), gekoppelt mit z. B. N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Zur Unterscheidung zwischen Isoform-spezifische Aktivitäten separate zellfreie Assays unter Einbeziehung jedes Isoform notwendig sind und möglicherweise nicht wider die echte Isoform Aktivität in lebenden Zellen. Isoform-spezifische Substrate sind im Handel erhältlich, wie z. B. Benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 spezifische Substrat) und (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic-Säure Tert-Butyl-Ester (BATCP, HDAC6 spezifische Substrat) (Abbildung 1 b). Allerdings wird ein Multi-Substrat-Gemisch mit MAL, MOCPAC und BATCP gegeben zu lebenden Zellen nicht die Erkennung der einzelnen deacetylated Produkte von fluorometrisch Messung erlauben angesichts der Tatsache, dass sie die gleichen spaltbaren Fluorophor tragen.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Erkennung und relative Quantifizierung jedes Substrat und ihrer deacetylated Produkte in HeLa-Zellen mit einem Multi-Substrat-Assay, gefolgt von UHPLC-ESI-MS/MS-Analyse17. Ein HDAC-Test wird auf HeLa-Zellen ermöglichen die direkte Identifizierung von HDAC hemmende Aktivität und der Besonderheit des Testverbindungen auf endogene HDACs durchgeführt. Gibt es ein Fokus auf HDAC1 und HDAC6, die gleichzeitig ausgewertet werden. Um diese enzymatischen Messungen in einem einzigen Inkubation Assay zu erreichen, ist eine Mischung aus unspezifischen und spezifischen HDAC-Substrate behandelten und unbehandelten HeLa-Zellen auf eine 96-Well-Platte vergoldet hinzugefügt. Im Anschluss an eine Inkubationsschritt sind Zellen lysiert, veröffentlichte er die Substrate und ihre jeweiligen Reaktionsprodukte, die sind getrennt und mit einer UHPLC-MS-Methode (Abbildung 1) nachgewiesen. Die deacetylated Produkte der MAL, MOCPAC und BATCP Substrate sind die deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) und deacetylated BATCP (dBATCP), beziehungsweise. Dosis-Wirkungs-Kurven können mit aktiven Verbindungen aufgebaut werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
Abbildung 1: allgemeine Regelung für die zellbasierte HDAC-Assay, HDAC1 und HDAC6-spezifische Inhibitoren durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. (A) Schema eines typischen 96-Well-Platte mit behandelt (Testverbindungen) und unbehandelten (Kontrolle) HeLa-Zellen, sowie zellfreie Rohlinge. (B) chemische Struktur von Substraten durch endogene HDACs deacetylated als eine Mischung (21 µM) hinzugefügt. (C) typische UHPLC-MS Chromatogramm zeigt die Gipfeln die hinzugefügte Substrate (MAL, MOCPAC und BATCP) und ihre deacetylated Produkte (dMAL, dMOCPAC, und dBACTP, beziehungsweise). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCP0168</td><td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>Tubastatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid, LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, HPLC grade</td><td></td><td></td><td>distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O filtered through a Milli-Q purification system</td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation reagent TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, cell culture grade</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA buffer</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast protease inhibitor tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td><td>VWR</td><td>29442-404</td><td>used in the centrifugation step</td></tr><tr><td>96-well plate, conical bottom, Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>249944</td><td>compatible with the Acquity UHPLC system</td></tr><tr><td>T75 cell culture flasks Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Peelable heat sealing foil</td><td>Waters</td><td>186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC system</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>Integration software: MassLynx V4.1</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr><tr><td>Combi thermo-sealer SP-0669/240</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr></tbody></table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

Die Suche nach neuen Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitoren ist zunehmend an Bedeutung in der Wirkstoffforschung. Isoform Selektivität ist die Genehmigung des Romidepsin, eine Klasse im Rampenlicht seit ich HDAC Inhibitor für Krebstherapie und die klinische Untersuchung der HDAC6-spezifische Hemmstoffe für Multiples Myelom. Das vorliegende Verfahren dient die inhibitorische Aktivität der Testverbindungen für HDAC1 und HDAC6 in den Zellen zu bestimmen. Die Isoform Aktivität wird anhand die ultra-high-Performance liquide Chromatography-Massenspektrometrie (UHPLC-MS) Analyse der spezifischen Substraten mit behandelten und unbehandelten HeLa-Zellen inkubiert. Die Methode hat den Vorteil der Reflexion der endogenen HDAC-Aktivität innerhalb der Umgebung der Zelle, im Gegensatz zur zellfreien biochemischen Assays auf isolierte Isoformen durchgeführt. Darüber hinaus da es auf die Quantifizierung der synthetische Substrate basiert, erfordert die Methode nicht die Antikörper Anerkennung der endogenen Schimmelpilzschäden Proteine. Es ist leicht anpassbar an verschiedene Zelllinien und einen automatisierten Prozess. Die Methode hat sich bereits bei der Suche nach HDAC6-selektive Verbindungen in Neuroblasten bewährt. Repräsentative Ergebnisse werden hier gezeigt, mit dem standard HDAC-Inhibitoren Trichostatin ein (unspezifisch), MS275 (HDAC1-spezifisch) und Tubastatin (HDAC6-spezifisch) mit HeLa-Zellen.

Die Anwendung der Methode zur Identifizierung von nicht-selektiven und selektiver Inhibitoren für HDAC1 nachweisen (Klasse I) und HDAC6 (Klasse IIb), HeLa-Zellen wurden mit bekannten standard-Compounds behandelt: Trichostatin A (nicht-selektiven zwischen HDAC1 und HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selektiver Hemmstoff)19und Tubastatin (HDAC6-selektiver Hemmstoff)20. Mithilfe der vorliegenden Methode (Abbild...

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Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Das vorliegende Verfahren dient der Isoform-spezifische Inhibitoren der Histon Deacetylases (HDAC) in HeLa-Zellen durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. Dies ist ein Antikörper-freie Methode entwickelt, um HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit im Wohnzimmer wiedergeben Zelle Umgebung, im Gegensatz zu Single-Isoform zellfreie Assays.

Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

simultaneous-measurement-hdac1-hdac6-activity-hela-cells-using-uhplc

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.5K Aufrufe.  Universités des Geneva–Lausanne (EPGL). Das vorliegende Verfahren dient der Isoform-spezifische Inhibitoren der Histon Deacetylases (HDAC) in HeLa-Zellen durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. Dies ist ein Antikörper-freie Methode entwickelt, um HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit im Wohnzimmer wiedergeben Zelle Umgebung, im Gegensatz zu Single-Isoform zellfreie Assays.

Serie: Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Forschung

Biochemie

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Krebsforschung

Histon-Proteomanalyse und posttranslationale Modifikationscharakterisierung

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Identifizierung von Histon-PTM-Isomeren durch LC-TIMS-TOF MS/MS und PASEF

An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [m/z] ratio).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

Chemie

Entwicklung eines Click-basierten Assays zum Screening der HAT1-Enzymaktivität

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Acetyl-Click-Assays für das HAT1-Inhibitor-Screening

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Biologie

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array of diverse posttranslational modifications (PTMs) that mostly occur in the amino termini of histone proteins (i.e., histone tail) and regulate the accessibility and functional state of the underlying DNA. Histone tails extend from the core of the nucleosome and are subject to the addition of acetyl groups by histone acetyltransferases (HATs) and the removal of acetyl groups by histone deacetylases (HDACs) during cellular growth and differentiation. Specific acetylation patterns on lysine (K) residues on histone tails determine a dynamic homeostasis between transcriptionally active or transcriptionally repressed chromatin by (1) influencing the core histone assembly and (2) recruiting synergistic or antagonistic chromatin-associated proteins to the transcription site. The fundamental regulatory mechanism of the complex nature of histone tail PTMs influences the majority of chromatin-templated processes and results in changes in cell maturation and differentiation in both normal and pathological development. The goal of the current report is to provide novices with an efficient method to purify core histone proteins from cells and brain tissue and to reliably quantify acetylation marks on histones H3 and H4.

The purpose of this article is to provide a comprehensive, systematic guide to the efficient purification of histones H3 and H4 and the quantification of acetylated histone residues.

Reinigung des H3 und H4-Histon-Proteine und die Quantifizierung der acetylierte Histone Noten in Zellen und Hirngewebe

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

Zusammenfassung

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Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Reinigung des H3 und H4-Histon-Proteine und die Quantifizierung der acetylierte Histone Noten in Zellen und Hirngewebe