Name: simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

Yazarlar maliyet eylem CM1406 kabul (epigenetik Kimya Biyoloji). Bu yayında bildirilen araştırma Pierre Mercier Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. hücre kültürü
Not: Standart doku kültürü mahallede aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Steril tekniği ile aşinalık bekleniyor.
<ol>
	<li>HeLa hücreleri için %80 confluency % 10 fetal sığır serum, penisilin G takıma MEM bir T75 hücre kültür şişesi içinde kültür (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/mL). Not: Hücre kültürü, tedavi ve lizis adımları %5 CO2 steril koşullarda oksijen bir ortamda gerçekleştirilen 37 ° C'de hücre kuluçka adımlarla laminar akış altında yapılmaktadır.</li>
	<li>5 mL DPBS de iki kez hücrelerle yıkama, DPBS Aspire edin ve hücre ayrılma reaktif 1 mL ekleyin. Hücreleri ayırmak 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>MEM kültür orta 9 mL ekleyin, iyice hücre süspansiyon resuspend ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>6 x 104 hücre/ml MEM içinde hücre süspansiyon yoğunluğunu ayarlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon, 100 µL denetimine ekleyin ve bir steril, düz dipli, doku kültürü tedavi 96-şey plaka (şekil 1A) kuyu test.</li>
	<li>MEM kültür ortamının 100 µL 96-şey plaka (şekil 1A) boş wells için ekleyin.</li>
	<li>96-şey plaka 24 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 24 h kuluçka HeLa hücreleri endojen HDAC etkinlik için test etmek için uygun bir zaman değil. Farklı hücre tipleri bilinmeyen HDAC aktivite ile kontrol hücreleri timecourse değerlendirilmesi gerekebilir.</li>
</ol>
2. hücre tedavisi ile Test bileşikleri ve HDAC yüzeylerde
<ol>
	<li>96-şey plaka kuyulardan orta Aspire edin.</li>
	<li>2 test bileşikler x 25 µL eklemek (örneğin, trichostatin A, MS275 ve tubastatin A) kuyu test etmek için MEM içinde. MEM 25 µL ve boş wells için ekleyin. Not: Test bileşiklerin en az 5 son test konsantrasyonları (başına iyi bir konsantrasyon) bir dizi sağlamak için ayarlanacak bölgedir. Bileşik testinde DMSO son konsantrasyonu % 0.5 geçmemelidir ve boşluklar ve denetimler de dahil olmak üzere her şey aynı olmalıdır. İyi ücret 50 µL son kuluçka birimdir. Trichostatin A 500 1.95 için arasında değişen 5 konsantrasyonlarda test nM (1:4 seyreltme). MS275 ve tubastatin A test 8.000 6.17 için arasında değişen 5 konsantrasyonlarda nM (1:6 seyreltme). Her test bileşik için istenen son test konsantrasyon her bireysel kullanıcı tarafından bir doz-yanıt eğrisi oluşturma tarafından tespit edilmelidir.</li>
	<li>Substrat karışımı (MAL, MOCPAC, 42 µM ve MEM BATCP 42 µM 42 µM) 25 µL kontrol ve test wells için ekleyin. MEM 25 µL boş wells için ekleyin. Not: Her substrat son konsantrasyonu 21 µM. olduğunu MOCPAC ve BATCP sırasıyla HDAC1 ve HDAC6 etkinlik arasında ayrım (şekil 1B). Hiçbir etkinlik ile bu yüzeylerde gözlenen zaman MAL kullanımı başka bir HDAC izoformu karşı faaliyetlerin tanımlaması için yol açması olası.</li>
	<li>96-şey plaka için oksijen %5 8 h 37 ° C'de kuluçkaya CO2 kuluçka makinesi. Not: Bu kuluçka süresi HeLa hücreleri için uygun ve endojen HDAC sentetik yüzeyler ile etkileşimine izin verir. Farklı hücre hatları kuluçka zaman ve/veya substrat konsantrasyonu ayarlamalar yapılması gerekebilir.</li>
</ol>
3. hücre lizis ve UHPLC-ESI-MS/MS için numune hazırlama
Dikkat: Son derece yanıcı ve yenmesi veya inhalasyon zehirli organik kimyasallar örnek hazırlık adımları kullanın. Eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruma giymek.
<ol>
	<li>10 µL (10 x RIPA arabelleğinden seyreltilmiş) 6 x RIPA arabelleği her de 96-şey plaka proteaz inhibitörü ile takıma ekleyin.</li>
	<li>Her şey soğuk Asetonitril 160 µL ekleyerek reaksiyonu durdurmak ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Not: Bu adım önce-20 ° C'de Asetonitril tutun.</li>
	<li>Plaka 10 dk-80 ° C dondurucuya koyun.</li>
	<li>Ve her şey içeriğinin 220 µL bir non-steril, konik-alt (V-alt) 96-şey plaka için transfer dondurucudan plaka çıkarın. Plaka 5000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Proteinler ve tuzları kaldırma bu adımı amaçlamaktadır. Gerekirse, çözümler bireysel konik santrifüj tüpleri Santrifüjü önce transfer veya 96-şey, 0.65 µm PVDF filtre plakaları bir grup üzerinden filtre. Çökelti başarılı kaldırılması UHPLC analiz önce gereklidir.</li>
	<li>UHPLC sistemi ile uyumlu bir 96-şey plaka içine süpernatant (veya filtrate) 200 µL transfer ve plaka sealer kullanarak soyulabilen, termo pişirme folyo folyo ile kapatın. Not: granül supernatants kaldırırken pipetting kaçının. UHPLC analiz hemen gerçekleştirilemez, plaka en fazla 24 h 4 ° C'de analiz kadar saklanabilir.</li>
</ol>
4. UHPLC/MS-MS analizi
<ol>
	<li>UHPLC sistem mobil faz sistemiyle (%95 A:5% B) doldurarak hazırlayın: A: %0,1 formik asit içeren H2O, HPLC-grade, (1 L hazırlamak) B: Asetonitril, HPLC-grade, %0,1 formik asit içeren (1 L hazırlamak). Dikkat: Mobil faz son derece yanıcı ve yenmesi veya inhalasyon zehirli organik kimyasallar içerir. Eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruma giymek.</li>
	<li>96-şey plaka plaka sahibi içeren örnek Yöneticisi yerleştirin. Tablo 1' de sağlanan UHPLC-ESI-MS/MS koşullara göre örneklerini çalıştırma. Not: Analitik 96-şey plaka her sütun bir denetim iyi ve bir boş iyi ( şekil 1Aplaka düzeninde tasvir) olmalıdır. MS kaynak tutarlı arka plan sağlayan olup olmadığını kontrol etmek için boşlukları varken % 100 test edilmiş hücre kültürünü enzimatik aktivite temsilcisi denetimleridir. Verilen boş olarak algılanan alışılmadık MS doruklarına MS duyarlılık değişiklikleri önlemek için araştırılmalıdır.</li>
</ol>
5. veri analizi
<ol>
	<li>Her yüzey ve deacetylated ürün pik alanı uygun bir UHPLC entegrasyon yazılımı ile entegre. Not: otomatik entegrasyon parametreleri düzeltme yöntemi (ortalama, pencere boyutu 3 ve 2, örneğin pürüzsüz sayısı) kullanın. Tablo 1' de sağlanan Kromatografik koşullar kullanarak, elüsyon dMAL (5,8 dk), dBATCP (6.0 dk), dMOCPAC (6.2 dk), MAL (7.6 dk), MOCPAC (8,9 dk) ve BATCP (9,8 dk), şekil 1 ciçinde tasvir sırasıdır.</li>
	<li>Her substrat (acetylated deacetylated?) / her Kromatografik (test ve denetim örnekleri) en yüksek alan oranını hesaplamak.</li>
	<li>Her test örneği yüzde HDAC inhibisyonu Hesapla: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg"> Not: HDAC1 inhibisyon dMOCPAC/MOCPAC pik alanı oranı kullanılarak hesaplanır; HDAC6 inhibisyon dBATCP/BATCP ile hesaplanır. Oranı dMAL/MAL genel HDAC inhibisyon ifade etmek için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+protein+families:+a+new+frontier+for+drug+discovery.">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li><li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+cellular+memory+and+gene+regulation.">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress.">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+p53+at+lysine+373/382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21(Waf1/Cip1).">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+in+transcriptional+regulation.">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li><li>Sim&#245;es-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases:+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs?.">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?.</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents.">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li><li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents:+A+critical+review.">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li><li>. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211)</li><li>. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012)</li><li>. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013)</li><li>. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015)</li><li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricolinostat+plus+lenalidomide,+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma:+a+multicentre+phase+1b+trial.">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li><li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+non-isotopic+assays+for+histone+deacetylase+activity.">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).</li><li>Zwick, V., Sim&#245;es-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS/MS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors.">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li><li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors.">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li><li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors.">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li><li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior,+neuroprotective+HDAC6+inhibitor,+tubastatin+A.">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li><li>Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+for+HDAC+Inhibitor+Hit+Validation.">Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation.</a> Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells.">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li><li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts.">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li><li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening.">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li><li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases.">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

HDAC inhibisyon geçerli odaklı bir kanser tedavisi21HDAC6-selektif inhibitörü ilaç keşif sıcak bir konudur. HDAC seçicilik genellikle bireysel HDAC izoformlarının21doğru inhibitör etki gücüne belirlemek niyetinde yüksek üretilen iş, boş hücre deneyleri bir dizi tarafından değerlendirilir. Ancak, bir inhibitörü selectivity ayrıca canlı hücrelerde Histon gibi endojen protein yüzeylerde asetilasyon durumunu değerlendirerek onaylandığı takdirde (i...

HDACs enzim Histon Kromatin yapısı içinde deacetylate mümkün bir aileye ait. Onlar da diğer protein yüzeylerde sitozol içinde ve çeşitli hücre bölmeleri içinde bulunurlar. 18 HDAC izoformlarının toplam defa tespit edilmiştir ve transkripsiyon faktörleri ve gen ifadesinin yanı sıra hücre sinyallemesi düzenlenmesi de dahil olmak üzere birkaç hücre mekanizmaları ile ilgili ve1,2,3,4,5,6,7taşıma. HDAC katalitik inhibitörleri kanser tedavisi için potansiyel terapötik ilaç olarak ortaya çıkmıştır. Şu anda FDA tarafından onaylanmış çoğu HDAC inhibitörleri T hücreli Lenfoma ve multiple Miyelom tedavisi için ve non-spesifik HDAC inhibitörleri, vorinostat (SAHA), belinostat ve panobinostat8,9gibi. Ancak, yan etkileri bir dizi pan-inhibitörleri ile ilişkili olmuştur ve izoformu özgü küçük moleküller için arama tıbbi kimya ve ilaç bulma gelen sıcak bir konudur. Buna göre sınıf ı (HDAC1-3 ve HDAC8) selektif inhibitörü romidepsin olduğunu bir onaylanmış durumdaki ilaç10, HDAC6 özgü inhibitörleri şu anda klinik çalışmalarda, Multipl Miyelom11,12,13,14,15artan tedavi potansiyele sahip altında iken.
Deneyleri HDAC karakterize etmek için eleme inhibitörleri (tek izoformu, nükleer özü veya hücre lysate) enzimatik kaynağı olan bir HDAC substrat kuluçka temel alır. Belgili tanımlık substrate genellikle N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16gibi bir yarilabilir fluorophore (Örneğin, coumarin) birleştiğinde bir asetil lizin kalıntı içeren bir küçük peptid sırası'dır. İzoformu özel etkinlikler arasında ayırt etmek için her izoformu içeren ayrı boş hücre deneyleri gerekli olan ve canlı hücreler gerçek izoformu etkinliğinde yansıtmıyor. İzoformu özel yüzeylerde Benzil gibi piyasada (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 belirli substrat) ve (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic asit tert-butil ester (BATCP, HDAC6 belirli substrat) (şekil 1B). Onlar aynı yarilabilir fluorophore ayı verilen bu ancak, MAL içeren bir çok substrat karışımı, MOCPAC ve canlı hücreler için verilen BATCP deacetylated ürünlerin tek tespiti Fluorometrik ölçüm tarafından izin vermeyeceğim.
Burada açıklanan yöntemi algılama ve her yüzey ve deacetylated ürün UHPLC-ESI-MS/MS analiz17tarafından takip bir çok maddeyi tahlil kullanarak HeLa hücreleri içinde göreli miktar olanak sağlar. Bir HDAC tahlil doğrudan kimlik HDAC inhibitör etkinliği ve özgüllük test bileşikler endojen HDACs etkinleştirmek için HeLa hücreleri üzerinde yapılan. HDAC1 ve HDAC6, aynı anda değerlendirilir bir odak vardır. Bir tek kuluçka tahlil enzimatik Bu ölçümlerde elde etmek için non-spesifik ve belirli HDAC yüzeylerde karışımı bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri eklenir. Bir kuluçka adım hücreleri yüzeylerde ve ayrılır ve bir UHPLC-MS (şekil 1 c) yöntemiyle tespit onların anılan sıraya göre tepki ürünler serbest bırakmak için lysed. MAL, MOCPAC ve BATCP yüzeylerde deacetylated ürünleri deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) ve deacetylated BATCP (dBATCP), sırasıyla vardır. Doz-yanıt eğrileri aktif bileşikler ile inşa edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
Şekil 1: HDAC1 ve HDAC6 özel inhibitörleri birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından tanımlamak hücre tabanlı HDAC tahlil için genel düzeni. Tipik 96-şey plaka tedavi (test bileşikleri) içeren bir(a)düzeni ve tedavi edilmezse (kontrol) HeLa hücreleri yanı sıra boş hücre boşlukları. (B) kimyasal yapısı yüzeylerde endojen HDACs tarafından deacetylated için bir karışım (21 her µM) eklendi. (C) eklenen yüzeylerde (MAL, MOCPAC ve BATCP) ve deacetylated ürünlerini doruklarına gösterilen tipik UHPLC-MS Kromatografik (dMAL, dMOCPAC ve dBACTP, sırasıyla). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCP0168</td><td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>Tubastatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid, LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, HPLC grade</td><td></td><td></td><td>distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O filtered through a Milli-Q purification system</td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation reagent TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, cell culture grade</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA buffer</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast protease inhibitor tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td><td>VWR</td><td>29442-404</td><td>used in the centrifugation step</td></tr><tr><td>96-well plate, conical bottom, Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>249944</td><td>compatible with the Acquity UHPLC system</td></tr><tr><td>T75 cell culture flasks Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Peelable heat sealing foil</td><td>Waters</td><td>186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC system</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>Integration software: MassLynx V4.1</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr><tr><td>Combi thermo-sealer SP-0669/240</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr></tbody></table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

Yeni Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri ilaç keşif ilgi artan bir arayıştır. İzoformu seçicilik romidepsin, bir sınıf onay beri spot oldu ben HDAC inhibitörü kanser tedavisi ve HDAC6 özgü yavaşlatıcılar, Multipl Miyelom için klinik incelenmesi için. Mevcut yöntemi HDAC1 ve HDAC6 hücrelerde test bileşikler inhibitör etkinliğini belirlemek için kullanılır. İzoformu etkinlik ultra yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (UHPLC-MS) analizi belirli yüzeylerde tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri ile inkübe ölçülür. Yöntem boş hücre biyokimyasal testleri izole izoformlarının üzerinde yürütülen aksine hücre ortamında endojen HDAC etkinliği yansıtan bir avantaja sahiptir. Ayrıca, sentetik yüzeylerde miktar üzerinde temel aldığından, yöntem antikor tanıma endojen acetylated proteinlerin gerektirmez. Birden fazla hücre satır ve otomatik bir işlemin kolayca uyarlanabilir. Yöntem zaten neuroblasts içinde HDAC6-seçici bileşikler bulmada faydalı olmuştur. Temsilcisi sonuçları are göstermek burada standart HDAC inhibitörleri trichostatin ile bir (non-spesifik), MS275 (HDAC1 özel) ve tubastatin (HDAC6 özel) kullanarak HeLa hücreleri.

Non-selektif ve selektif inhibitörü HDAC1 için tanımlayıcı uygulamanın yönteminin göstermek için (sınıf ı) ve HDAC6 (sınıf IIB), HeLa hücreleri bilinen standart bileşenleri ile tedavi: trichostatin A (non-selektif HDAC1 ve HDAC6 arasında)18, MS275 (HDAC1-selektif inhibitörü)19ve tubastatin (HDAC6-selektif inhibitörü)20. Mevcut yöntem (şekil 1) kullanarak, ŞA5...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Mevcut Yöntem birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından Histon uyku (HDAC) HeLa hücreleri izoformu özgü inhibitörleri tanımlanmasını sağlar. Bu yaşam HDAC1 ve HDAC6 etkinliği yansıtmak üzere geliştirilen bir antikor-Alerjik yöntemdir tek-izoformu boş hücre deneyleri aksine hücre çevre.

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

simultaneous-measurement-hdac1-hdac6-activity-hela-cells-using-uhplc

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.5K Görüntüleme.  Universités des Geneva–Lausanne (EPGL). Mevcut Yöntem birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından Histon uyku (HDAC) HeLa hücreleri izoformu özgü inhibitörleri tanımlanmasını sağlar. Bu yaşam HDAC1 ve HDAC6 etkinliği yansıtmak üzere geliştirilen bir antikor-Alerjik yöntemdir tek-izoformu boş hücre deneyleri aksine hücre çevre.

Video: Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Biyokimya

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Kanser Araştırmaları

Histon Proteomik Analizi ve Translasyon Sonrası Modifikasyon Karakterizasyonu

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Yazar Spotlight: LC-TIMS-ToF MS/MS ve PASEF aracılığıyla gelişmiş histon PTM izomer tanımlaması

An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [m/z] ratio).

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

Kimya

HAT1 Enzim Aktivitesinin Taranması için Tıklama Tabanlı Bir Testin Geliştirilmesi

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Yazar Spotlight: HAT1 İnhibitörü Taraması için Asetil-Tıklama Testi Geliştirme

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Biyoloji

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array of diverse posttranslational modifications (PTMs) that mostly occur in the amino termini of histone proteins (i.e., histone tail) and regulate the accessibility and functional state of the underlying DNA. Histone tails extend from the core of the nucleosome and are subject to the addition of acetyl groups by histone acetyltransferases (HATs) and the removal of acetyl groups by histone deacetylases (HDACs) during cellular growth and differentiation. Specific acetylation patterns on lysine (K) residues on histone tails determine a dynamic homeostasis between transcriptionally active or transcriptionally repressed chromatin by (1) influencing the core histone assembly and (2) recruiting synergistic or antagonistic chromatin-associated proteins to the transcription site. The fundamental regulatory mechanism of the complex nature of histone tail PTMs influences the majority of chromatin-templated processes and results in changes in cell maturation and differentiation in both normal and pathological development. The goal of the current report is to provide novices with an efficient method to purify core histone proteins from cells and brain tissue and to reliably quantify acetylation marks on histones H3 and H4.

The purpose of this article is to provide a comprehensive, systematic guide to the efficient purification of histones H3 and H4 and the quantification of acetylated histone residues.

Arıtma H3 ve H4 histon proteinleri ve Acetylated histon işaretleri hücrelerinde ve beyin dokusu miktar

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Arıtma H3 ve H4 histon proteinleri ve Acetylated histon işaretleri hücrelerinde ve beyin dokusu miktar