Name: scaffold-supported transplantation of islets in the epididymal fat pad of diabetic mice
Uploaded: 2017-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice at JoVE.com

Die Autoren danken Wei Zhang von Guanhao Biotech für die Bereitstellung der dezellularen Gerüste. Wir danken Xiao-hong Peng für die hilfreichen Diskussionen. Diese Forschung wurde finanziell unterstützt von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Projekt Nr.31322021).

Alle Experimente wurden vom Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC Nr. COE-LuoY-1) genehmigt. 1. Islet Isolation <ol><li> Vorbereitung von Reagenzien und Geräten. <ol><li> Rekonstituieren Sie Collagenase P Pulver (2 U / mg) in HBSS, um eine 5 mg / ml Lösung herzustellen, und filtrieren Sie sie durch einen 0,22 μm Filter, um die Bakterien zu entfernen. 0,6 ml Aliquot-Lösungen von Collagenase P in 15-ml-konischen Röhrchen vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren. HINWEIS: Während des Gebrauchs wird jedes Aliquot mit HBSS verdünnt, um 6-ml-Arbeitslösungen mit Endkonzentrationen von 0,5 mg / ml oder 1 U / ml (ausreichend zur Behandlung von 3 Mäusen) zu ergeben. Die Arbeitslösung wird innerhalb von 1 h auf Eis für den sofortigen Gebrauch aufbewahrt. Die Arbeitslösung sollte nicht für einen zusätzlichen Gebrauch wiederhergestellt oder wieder eingefroren werden. </li><li> Vorbereitung der Neutralisationslösung durch Zugabe von FBS (2,5%) und P / S (1%) in HBSS; Halten Sie die Lösung auf Eis. 60 ml Neutralisationslösung auf Trea vorbereitenT 6 Mäuse </li><li> Für das Islet-Kulturmedium wird D-Glucose (7 mM), FBS (10%) und P / S (1%) zu RPMI 1640 Medium gegeben. </li><li> Autoklavieren Sie die Chirurgiegeräte bei 115 ° C für 30 min und 15 psi Druck. </li></ol></li><li> Inflation der Bauchspeicheldrüse <ol><li> 12 ml Kollagenase-Arbeitslösung, wie in Schritt 1.1.1 angegeben, für 6 Mäuse (12 Wochen alt) vorbereiten. Füllen Sie die 10 ml Spritze mit 9 ml Arbeitslösung und verbinden Sie die Spritze mit der 27 G intravenösen Nadel. Die Spritze auf Eis aufbewahren und die Lösung innerhalb von 1 h verwenden. </li><li> Euthanisieren Sie die Maus durch zervikale Versetzung. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch, wobei der Schwanz auf den Bediener zeigt. Spray den ganzen Körper mit 70% Ethanol, so dass es völlig nass. </li><li> Machen Sie eine V-Inzision, beginnend mit dem Genitalbereich und erstreckt sich bis zum Zwerchfell, mit Sektionsscheren und Pinzetten. Falten Sie die Haut über die Brust, um die Bauchhöhle vollständig zu enthüllen. </li><li> BewegungDen Darm auf der rechten Seite der Maus und setzen die Bauchspeicheldrüse und gemeinsame Gallengang. Greifen Sie den Duodenum sorgfältig mit Pinzette und ziehen Sie ihn, bis der Gallengang straff ist ( Abbildung 1A -1 und A-2 ). </li><li> Finde die Pfortader und Gallengang in die Leber. Klemmen Sie die Pfortader und den Gallengang mit einer mikroskopischen hämostatischen Klemme. HINWEIS: Die Klemmung verhindert eine übermäßige Blutung und den Eintritt der Kollagenase in die Leber. </li><li> Während sie den Darm noch mit der Pinzette halten, finden Sie die Lage der Ampulle, die den Gallengang und den Duodenum verbindet. Setzen Sie die 27G intravenöse Nadel in den gemeinsamen Gallengang durch die Ampulle ein ( Abbildung 1B -1 und B-2 ). </li><li> Geben Sie etwa 200 μl Collagenase-Arbeitslösung an, um zu überprüfen, ob die Kanüle den ganzen Weg durch Gallengang ist. Wenn die Kollagenase-Lösung beginnt, den Kanal zu füllen ( 1 und C2 ), die Nadel befindet sich im Lumen des Kanals; Klemmen Sie das Kanalsegment, das die Nadel enthält, mit einer hämostatischen Arterie-Klemme und geben den Rest der 2-ml-Lösung mit einer langsamen und konstanten Geschwindigkeit innerhalb von 1 min ab ( Abbildung 2A- 1 , A-2 und B-1 ). HINWEIS: Wenn das Gewebe, das den Kanal umgibt, aufzublasen beginnt ( Abbildung 2B -2 ), hat sich die Nadel durch die Wand des Gallenganges gestoßen, was es notwendig macht, die Nadel neu zu positionieren und den Gallengang wieder zu kanieren. Ähnlich, wenn das Duodenum beginnt zu blasen ( Abbildung 2C -1 und C-2 ), muss die Arterie hämostatische Klemme angepasst werden und die Gallengang wieder kanüliert werden. Als die Kollagenase-Lösung die Bauchspeicheldrüse füllt, pflanzt sich das Gewebe in der Nähe des Duodenums zuerst, gefolgt von der RegioN in der Nähe des Bauchspeicheldrüsenschwanzes Die Perfusion des Pankreasschwanzes (der Milzlappen) ist wichtig, um die Islet-Ausbeute zu maximieren. </li><li> Nach dem vollständigen Aufblasen der Bauchspeicheldrüse ( Abb. 2C -1 ) schieben Sie den Darm auf die linke Seite der Maus und entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie am absteigenden Dickdarm beginnen. Benutze die Pinzette, um den Darm zu heben und ihn von der Pankreas mit einer anderen Pinzette zu trennen. Weiter, um die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, bis sie von der Oberseite des Magens ungebunden ist. Schließlich hebe die Bauchspeicheldrüse aus dem Bauch und schneide es von der verbleibenden Milz frei. HINWEIS: Die gesamte Trennung sollte schnell durchgeführt werden, da die Verdauung während des Entfernungsvorgangs fortgesetzt wird. </li><li> Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine leere 15-ml-Kegelröhre und lassen Sie sie auf Eis. Wiederholen Sie den obigen Vorgang für die verbleibenden Mäuse. Alle Bauchspeicheldrüse sollten innerhalb von 1 h weiterverarbeitet werden, um sofort nach Schritt 1.3 zu verhindern, um eine Überverdauung durch Kollagenase P zu verhindern/ Li&gt; </ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg" /> Abbildung 1: Fotografien, die die Kanülierung des Gallenganges und die Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit Kollagenaselösungen zeigen. ( A1 ) Ziehen des Duodenums, bis der Gallengang straff ist (Ampulla: die dreieckige, milchige Fläche auf der Oberfläche des Duodenums, Gallengang: die kordelartige milchige Struktur auf der Oberfläche). ( B1 ) Einsetzen der Nadel in den Gallengang von der Ampulle. ( C1 ) Aufblasen der Bauchspeicheldrüse mit der Injektion von Enzym. ( A2, B2 und C2 ) Karikaturbilder der in A1, B1 und C1 gezeigten Verfahren. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Fehlersuche für die Kanüle. ( A1 ) Die Nadelspitze, die in das Lumen des Gallenganges eingeführt ist. ( A2 ) Der Kanal mit Enzymlösungen gefüllt. ( B1 ) Die Nadel, die in das Lumen des Gallenganges eingeführt wurde, und die mit einem blauen Farbstoff gefüllte Leitung. ( B2 ) Aufgrund der ungeeigneten Kanülen befindet sich die Nadel unter dem Gallengang, und nach der Abgabe des blauen Farbstoffs wird nur eine aufgeblasene Kapsel beobachtet. ( C1 ) Eine erfolgreiche Kanülierung wird durch die Ausdehnung der Bauchspeicheldrüse belegt. ( C2 ) Durch unangemessenes Klemmen tritt blauer Farbstoff in den Duodenum ein und verursacht eine Dehnung. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> &lt;Stark&gt; Verdauung und Reinigung von Inselchen. <ol><li> Inkubieren Sie die konischen Röhrchen, die die perfundierte Pankreas bei 37 ° C für 17 min enthalten. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Alter und Tierart variieren. </li><li> Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 7 ml Neutralisationslösung hinzufügen und die Röhrchen auf Eis stellen. </li><li> Dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhrchen kräftig schütteln ( z. B. 20 mal in 10 s), bis feine Gewebepartikel erhalten werden. HINWEIS: Die Ertragsausbeute ist niedrig, wenn die Bauchspeicheldrüse nicht vollständig dissoziiert. </li><li> Filtern Sie die verdauten Gewebeproben durch 0,5 mm Maschendraht, um alle nicht verdauten Gewebestücke zu entfernen. Sammeln Sie die Insel-Suspensionen in einem neuen 50-ml-Kegelrohr. </li><li> Die Röhrchen für 3 min bei 230 xg und 4 ° C zentrifugieren und den Überstand sorgfältig ausgießen, ohne die Gewebepellets zu stören. </li><li> Die Pellets von 3 Mäusen in 4 ml Polysucrose-Dichtegradienten durch Vortexen sanft oder p resuspendierenDie Aufhängung auf und ab ein paar Mal. Langsam pipettieren 4 ml HBSS an der Seite des Röhrchens an die Spitze der Polysucrose-Lösungen. HINWEIS: Die beiden Lösungen sollten gut getrennte Schichten mit einer scharfen Schnittstelle sein. HINWEIS: Der Zusatz von HBSS sollte sorgfältig durchgeführt werden, ohne den Polysucrose-Dichtegradienten am Boden zu stören. </li><li> Die Suspension für 20 min bei 900 xg und 4 ° C zentrifugieren, indem man eine sehr langsame Beschleunigungsrate auswählt. Die Zentrifugation ohne Bremse beenden ANMERKUNG: Dies ist ein Schritt, um die Inselchen aus den exokrinen Zellen zu reinigen, wobei die meisten Inseln auf die Grenzfläche zwischen den Schichten von Polysucrose und HBSS und den meisten exokrinen Zellen, die sich am Boden absetzen, wandern. </li><li> Entfernen Sie die Gesamtheit der 8-ml-Überstandslösungen mit einer großvolumigen 15-ml-Pipette. Führen Sie die Lösungen durch ein umgekehrtes 70-μm-Sieb. HINWEIS: Die Inselchen werden weiter gereinigt und durch das Sieb zurückgehalten, während die exokrinen ZellenWird durch den Filter gehen. Achtung: Der Polysucorse-Dichtegradient ist zelltoxisch; Die Filtration hilft den Inselchen, die Polysucrose loszuwerden. </li><li> 2 ml kalte Neutralisationslösung in eine 35-mm-Petrischale pipettieren. Umkehren Sie den Zellsieb nach rechts, tauchen Sie die Oberfläche ein, die die Inselchen in der Lösung hält, und schütteln Sie sanft, um die Inselchen freizugeben. </li><li> Hand-Pick die Inselchen unter einem Mikroskop mit einer 20-μL-Pipette mit einer weißen Spitze. ANMERKUNG: Die Inselchen sind gelbliche, kompakte Zelle Aggregate ( Abbildung 3A ), während das kontaminierende exokrine Gewebe oder die Zellen eine schwärzliche und lockere Struktur unter dem Sektionsmikroskop haben. </li><li> Platzieren Sie etwa 200 Inseln in einer 35-mm-Schale mit 2 ml Kulturmedium und inkubieren bei 37 ° C in einem Inkubator, der mit 5% CO 2 für 12 h versorgt wird. HINWEIS: In der Regel können 150-300 Inselchen aus einer 12-wöchigen C57BL / 6J Maus geerntet werden. Die Inseln sind anfällig für die Bildung von Aggregaten während der Kultur,Und die großen Inseln (&gt; 300 μm) sind anfällig für zentrale Nekrose ( Abbildung 1B , Inset). Schütteln Sie die Suspension gut, um die Inseln in der Schale gleichmäßig zu verteilen und das Klumpen zu reduzieren. </li></ol></li></ol> 2. Inselkultur auf dem Gerüst HINWEIS: DCS hat eine Porosität von etwa 79%, eine Dicke von etwa 0,6 mm und eine Porengröße im Bereich von 12 bis 300 μm. <ol><li> Schneiden Sie die Gerüste in 7-mm-Scheiben, tränken Sie sie in 70% Ethanol und waschen Sie sie mit HBSS. Legen Sie die Gerüste in die 24-Well-Gewebekultureinsätze. HINWEIS: Wenn frische Inseln nach der Übernachtkultur gewonnen werden, erscheinen die Inseln hell und dicht mit glatten Rändern ( Abbildung 3B ). </li><li> Stanzen Sie die Schale und sammeln Sie die Inselchen aus der Mitte der Schale mit einer 20 μl Pipette mit einer weißen Spitze. Übertragen Sie die Inselchen auf die Gerüste (250 Inselchen / Gerüst) mit einer Pipette und fügen Sie 2 ml Kulturmedium hinzuder Brunnen. Kultur die Inselchen für 12 Stunden vor der Transplantation. </li></ol> 3. Insertransplantation auf der EFP-Seite <ol><li> Diabetes-Induktion bei Empfänger-Mäusen. <ol><li> Legen Sie C57BL / 6J Mäuse (mehr als 10 Wochen alt) in einem frischen Käfig mit einer Wasserversorgung aber kein Essen. Schnell die Mäuse für 10 Stunden vor der Induktion von Diabetes. </li><li> Vorbereiten von Pufferlösungen mit pH-Werten von 4,2-4,5 durch Mischen von 0,1 M Zitronensäure mit 0,1 M Natriumcitrat. Lösen Sie STZ (10 mg / ml) in den frisch hergestellten Puffer und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch ein 0,22 μm Filter passieren. HINWEIS: STZ ist lichtempfindlich und verliert innerhalb von 10 min die Aktivität. Immer die frische STZ-Lösung vor der Injektion vorbereiten. </li><li> Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit STZ in einer Dosis von 140-150 mg / kg für jede C57BL / 6J Maus. HINWEIS: Die Dosis variiert je nach Alter und Tierart. Es wird empfohlen, eine kleine Dosierungsoptimierung durchzuführenSt für die gegebene Spezies vor Beginn des formalen Experiments. </li><li> Sammle das Schwanzvenenblut und überwache den Blutzucker mit einem Glukosemessgerät an den Tagen 2, 3 und 4 nach der STZ-Injektion. HINWEIS: Wenn die Tiere an zwei aufeinanderfolgenden Tagen hyperglykämisch (nicht-fastender Blutzucker&gt; 16,7 mM) sind, sind sie bereit für die Inseltransplantation. </li></ol></li><li> Transplantation von Inselchen zur EFP-Stelle. <ol><li> Betäubt die Mäuse mit pentobarbital intraperitoneal (50 mg / kg). Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch, wobei der Schwanz auf den Bediener zeigt. Rasieren Sie den Bauch ausgiebig, um das Fell von der Inzisionsstelle zu entfernen. Tape down die vier Gliedmaßen und tupfen Sie die Haut komplett mit wechselnden Alkohol und Iodophor Wipes bewegt sich kreisförmig, um die Inzisionsstelle zu sterilisieren. Drapieren Sie die Maus mit einem sterilen Tuch, nur den Zugang zum Schnittbereich. Machen Sie einen 7 mm Einschnitt durch die Peritonealwand in derMittellinie, nah am Genitalbereich. HINWEIS: Alle Instrumente, die während der Operation verwendet werden, einschließlich Handschuhe, sollten steril sein. </li><li> Vorsichtig holen und entfernen Sie die EFP aus der Bauchhöhle mit Pinzette. Verbreiten Sie die EFP auf benetzte sterile Gaze. Legen Sie das Gerüst, das Inselchen enthält, auf dem EFP und falten Sie das EFP, um das Transplantat zu wickeln. Sichern Sie den direkten Kontakt zwischen den Inselchen und EFP, indem Sie das EFP mit resorbierbaren 6-0 Nahtnähten nähen. Benetzen Sie die Oberfläche des EFP mit steriler Kochsalzlösung mit einem getränkten Wattestäbchen, um zu verhindern, dass das EFP austrocknet. </li><li> Legen Sie den EFP vorsichtig wieder in die Bauchhöhle. Schließen Sie den Schnitt durch Nähen der Peritonealwand und Klemmen der Dermalschicht mit Wundclips. </li><li> Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan als Analgetikum injizieren. </li><li> 1 ml Salzlösung subkutan injizieren, um eine Austrocknung zu verhindern. </li><li> Lege die Maus in einen Käfig auf ein Heizkissen, bis sich die Maus von der Anästhesie erholt. </li><li> Überprüfen Sie die nicht-fastenden Glukose leVels zwei Tage später durch das Sammeln von Blut aus der Schwanzvene. Wenn Sie das Transplantat abholen, wiederholen Sie die oben genannten Transplantationsverfahren, ziehen Sie den EFP vorsichtig heraus, verwenden Sie 3-0 Naht, um das Ende des Fettkissens neben dem Nebenhoden zu lindern, die Blutgefäße zu verschließen, das EFP-Transplantat zu explantieren und es für die Histologie zu bewahren . ANMERKUNG: Das Explantieren der Inselchen sollte den Empfänger Mäusen hyperglykämisch innerhalb von 3 Tagen wiedergeben, was die Funktion des Transplantats bestätigt. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Pankreas-Perfusion und Verdauungszeit sind zwei Schlüsselparameter, die die Ertragsausbeute und -qualität beeinflussen. Moskalewski berichtete zuerst über die Verwendung einer rohen Kollagenase-Mischung, um gehackte Meerschweinchen-Pankreas zu verdauen 11 . Lacy et al. die Injektion von Enzymen in das Kanalsystem berichtet , die Bauchspeicheldrüse perfundieren, die die Insel Ausbeute 12 stark erhöht. Die duktale Perfusion des Enzyms ermöglicht die maximale Exposition der Pankreasoberfläche gegenüber dem Enzym, was zu einer homogeneren Verdauung und einer größeren Freisetzung von intakten Inselchen im Vergleich zur Verdauung von Hackbrunnen 13 führt . In unserer Erfahrung waren die erfolgreiche Kanülierung des Gallenganges und die Perfusion der ganzen Bauchspeicheldrüse Voraussetzungen für hohe Ertragsrenditen. Dies liegt daran, dass der Pankreasschwanz (Milzlappen) tatsächlich die meisten Inseln enthält, verglichen mit dem Pankreasgewebe in der Nähe des Duodenums. Es gibt zwei Möglichkeiten zu kanulieren<html> Der Gallengang, der in der Literatur berichtet wird: i) Einsetzen der Nadel in die Nähe der Leberstelle, während der Eintritt des Enzyms in den Duodenum 13 , 14 und ii) blockiert wird, indem man die Nadel in die Nähe des Duodenums einsetzt, während der Eintritt des Enzyms in die Leber 15 Hier haben wir die letztere Technik angenommen, die keine Biegung der Nadel oder die Neupositionierung der Maus erfordert. Ein gut ausgebildeter Forscher kann die Kanüle von 10 Mäusen innerhalb von 40 min nach unserem Protokoll durchführen. Die Verdauungszeit für die Bauchspeicheldrüse variiert mit dem Alter und den Arten der Mäuse. Über-verdaute Bauchspeicheldrüse produzieren kleine Inselchen und unter-verdaute Bauchspeicheldrüse haben Acin-Zellen an die Inselchen befestigt. Es ist daher wichtig, die Verdauungszeit zu optimieren, um hohe Ausbeuten an gesunden Inseln zu erhalten. STZ ist eine antibiotische Verbindung, die speziell Beta-Zellen zerstört und Diabetes bei Mäusen innerhalb von 3 Tagen induziertSs = &quot;xref&quot;&gt; 16 Die Dosierung variiert mit dem spezifischen Mausstamm und Alter und sollte durch Vorversuche bestimmt werden. Nach unserem Wissen benötigen C57BL / 6J-Mäuse eine niedrigere Dosis von STZ als Balb / C-Mäuse. Eine Überdosierung von STZ würde zu schweren Hyperglykämien führen und zum Tod der Tiere innerhalb einer Woche führen, während eine unzureichende STZ-Dosis die Diabetes-Inzidenzrate senkt. EFPs sind hoch vaskularisierte Gewebe und bequem zugänglich für Chirurgie durch minimal-invasive Verfahren. Die Transplantation von Inselchen zu EFP ist im Allgemeinen einfacher und sicherer im Vergleich zu der Nierenkapsel, eine andere häufig gemeldete Stelle für die Inseltransplantation bei Mausmodellen. Insbesondere ist die Niere ein wesentliches Organ und ist zart zu handhaben; Die Transplantation von Inselchen kann fehlschlagen oder die Tiere dürfen die Operation nicht überleben 4 . Die EFPs bei Mäusen ähneln auch dem Omentalbeutel beim Menschen. Die Transplantationsstudie in EFP kann uns nicht nur erleichternVerständnis der Voraussetzung der Gewebeumgebung für das Überleben / Funktionieren der Insel, aber auch die Grundlage für die Entwicklung von klinischen Transplantationsverfahren 17 . Die DCS, die in dieser Studie verwendet wurde, wurde aus Rinderperikard gewonnen und wurde hauptsächlich aus Kollagen hergestellt. Die dezellularisierten Materialien zeigen nicht Immunogenität und kann nur milde Entzündungsreaktionen in vivo 18 induzieren. Als die Inselchen in den Poren des DCS ausgesät wurden, bot das Gerüst einen mechanischen Schutz und verhinderte, dass die Inselchen zusammenstoßen, was zur Nekrose der Inselchen führen könnte. Das DCS-Gerüst, das die Inselchen enthält, konnte direkt mit einer Pinzette gehandhabt werden, was die leichte Übertragung des Transplantats ermöglicht. Die Einbettung der Gerüste innerhalb des EFP reduzierte auch das Auslaufen von Inselchen in das Peritoneum, anders als in den freien Inselchen, die ohne Gerüst verpflanzt wurden 8 . Daher liefert das DCS distincT Vorteile für die Inseltransplantation.

Typ 1 Diabetes mellitus (T1D) ist eine autoimmune endokrine Störung, in der Inselzellen durch das Immunsystem ablatiert werden, wodurch Patienten abhängig von der Injektion von exogenem Insulin für ihr ganzes Leben sind. Das Edmonton-Protokoll stellt einen Meilenstein in klinischen Studien der Inselentransplantation dar; Inselchen wurden durch die Pfortader infundiert und an der intrahepatischen Stelle transplantiert 1 . Doch zwei Haupthindernisse - unzureichende Quellen von Spenderinseln und schlechte Inselentransplantation - verhindern den breiten Erfolg der Inselentransplantation 2 . Normalerweise müssen Inselchen von drei kadaverischen Spendern gesammelt werden, um den hyperglykämischen Zustand eines Patienten umzukehren; Dies ist auf die geringe Ausbeute an Islet-Isolationsverfahren und den Inselverlust nach der Transplantation zurückzuführen. Insbesondere, obwohl die Nachtransplantationsinseln in sauerstoffreichem Blut gebadet wurden, zeigte der direkte Kontakt mit dem Blut oft das augenblicklich blutvermittelte Entzündungsmittel(IBMIR), die den akuten Verlust der Inselchen verursachen könnten. Langfristig wird angenommen, dass der allmähliche Verlust von Inselchen bei Patienten für den Tropfen der Diabetes-Umkehrraten in den klinischen Gruppen verantwortlich war, die im ersten Jahr 90% erreichen konnten und auf 30% und 10% um 2 und 5 sanken Jahre nach der Transplantation bzw. 3 . Die Islet-Transplantation an extrahepatischen Stätten war eine attraktive Strategie, um den direkten Kontakt von Inselchen mit Blut zu reduzieren und die Transplantationen im Vergleich zur intrahepatischen Infusion an definierbare Stellen zu beschränken. In den Nierenkapseln, Augen, Muskeln, Fettpolstern und subkutanen Räumen wurden in den vergangenen Jahren Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, dass Inselchen an diesen Standorten in der Lage sind, zu überleben und zu funktionieren, um die Normoglykämie wiederherzustellen 4 . Darüber hinaus sind die Inselchen an diesen Standorten abrufbar, was eine Biopsie oder sogar für weitere Ersatzverfahren ermöglicht. Extrahepatische sDaher zeigen sie ein großes Potential für die klinische Transplantation 5 . Biomaterialbasierte Gerüste wurden intensiv für Zelltransplantation und Tissue Engineering untersucht. Dreidimensionale (3D) Gerüste enthalten in der Regel poröse Strukturen und können als zelluläre Schablonen dienen, um räumliche Struktur / Organisation von Zellen oder als Reservoirs zu erzeugen, um die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Cues zu ermöglichen. Gerüste wurden auch aus polymeren Materialien wie Poly (glycolid-L-lactid) 6 , Poly (dimethylsiloxan) 7 und thermoplastischem Poly (urethan) 8 hergestellt , um Inselchen im EFP zu transplantieren. Im Vergleich zur direkten Transplantation von Inselchen wurde festgestellt, dass die Verwendung von Gerüsten den Islet-Verlust verringert, indem das Auslaufen von Inselchen in den intraperitonealen Hohlraum 9 , 10 verhindert wird , was mechanischen Schutz und modu bereitstelltDie lokale entzündliche Reaktion. Die Gerüste können so entwickelt werden, um die Inselentransplantation an den Transplantationsstellen zu fördern 7 . In dieser Studie beabsichtigen wir, ein Paradigma der Inselentransplantation im EFP zu demonstrieren, das in Mäusemodellen mit einem DCS durchgeführt wird. Gerüste aus extrazellulären Matrizen haben in den letzten Jahren großes Interesse an der überlegenen Biokompatibilität und natürlicheren porösen Strukturen im Vergleich zu synthetischen Produkten. Hier beschreiben wir ein robustes Isolationsprotokoll, um Pankreasinseln mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen zu erhalten. DCSs, die aus dem Rinderpericardium verarbeitet wurden, wurden dann mit Eseln ausgesät und die Transplantate wurden in syngene diabetische Modelle in die EFP transplantiert. Die Normoglykämie bei Mäusen wurde innerhalb von 10 Tagen erreicht und bis zu 100 Tage bis zur Entfernung der Transplantate aufrechterhalten.

<table><tbody><tr><td>Dissecting scissor</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm diameter wire mesh</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Artery hemostatic clamp</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopic hemostatic clamp</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic forceps</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbable 6-0 PGLA sutures&amp;nbsp;</td><td>JINHUAN</td><td></td><td>With needle</td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10mL syringe</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G intravenous needle</td><td>JINGHUAN</td><td>0.45x15 RWSB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>35mm Non-treated&amp;nbsp; Peri-dishes</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filter</td><td>Pall</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipet filler S1</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (2-20&amp;mu;L)</td><td>Axygen</td><td>AP-20</td><td>AXYPET&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500CP</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>COLLP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Gibco</td><td>A24940-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose meter</td><td>Roche</td><td></td><td>ACCU-CHEK</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigma</td><td>V900890</td><td>Vetec&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Chloral hydrate</td><td>J&amp;amp;K</td><td>C0073</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Iodophors</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J, 10-12 weeks old</td><td>VitalRiver</td><td></td><td>Beijing, China</td></tr><tr><td>Decellularized scaffold</td><td>Guanhao Biotec</td><td>131102</td><td>Guangzhou, China</td></tr></tbody></table>

scaffold-supported transplantation of islets in the epididymal fat pad of diabetic mice

Die Islet-Transplantation wurde klinisch als wirksam bei der Behandlung von Typ-1-Diabetes erwiesen. Allerdings kann die aktuelle intrahepatische Transplantationsstrategie akute Vollblutreaktionen hervorrufen und zu einer schlechten Inselentransplantation führen. Hier berichten wir über ein robustes Protokoll zur Transplantation von Inselchen an der extrahepatischen Transplantationsstelle - dem epididymalen Fettpolster (EFP) - bei einem diabetischen Mausmodell. Ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Inselchen mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen wird beschrieben, sowie ein Transplantationsverfahren, das durch Seeding-Inseln auf ein dezelluläres Gerüst (DCS) durchgeführt wird und sie an der EFP-Stelle in syngenen C57BL / 6J-Mäusen, die Diabetiker übertragen werden, implantiert Durch Streptozotocin. Das DCS-Transplantat, das 500 Inseln enthält, hat den hyperglykämischen Zustand innerhalb von 10 Tagen umgekehrt, während die freien Inseln ohne DCS mindestens 30 Tage benötigt werden. Die Normoglykämie wurde bis zu 3 Monate aufrechterhalten, bis das Transplantat explantiert wurde. Abschließend erhöhte DCS die Einlagerung von Inselchen in tDie extrahepatische Stelle des EFP, die leicht abgerufen werden könnte und eine reproduzierbare und nützliche Plattform für die Untersuchung der Gerüstmaterialien sowie andere Transplantationsparameter für eine erfolgreiche Insert-Engagement zur Verfügung stellen könnte.

Unsere Klemmmethode, die mit einer mikroskopischen hämostatischen Klemme durchgeführt wird, ist im Vergleich zur Naht-Ligationstechnik einfach und zeitsparend. Es dauerte etwa 4 h, um etwa 1.200 Inselchen aus 6 Mäusen zu isolieren und zu reinigen. Die frisch isolierten Inseln hatten typischerweise eine grobe Peripherie unter einem optischen Mikroskop ( Fig. 3A ). Sobald sich die Inselchen aus dem Isolationsprozeß erholten, sahen sie hell und fest und erhielten eine glatte Oberfläche. Allerdings könnte die stressige Isolation noch den Zelltod induzieren, was zu einem Schlagen von Zellen aus den Inselchen führt und ungesunde Inseln oft einen dunklen nekrotischen Kern enthielten ( Abbildung 3B ). Wir messen die Durchmesser von 945 Inseln von 5 Mäusen; Der berechnete mittlere Islet-Durchmesser betrug 130,42 ± 41,75 &amp; mgr; m ( 3C ). Um Empfänger immun zu vermeiden<html> Ablehnung, haben wir syngene Transplantation in C57BL / 6J Mäusen durchgeführt. Typischerweise wurden 500 Inselchen beladene DCS an die Stelle des EFP transplantiert und die Hyperglykämie innerhalb von 10 Tagen umgekehrt, verglichen mit den 30 Tagen, die in der freien Inselgruppe beobachtet wurden. Die Normoglykämie wurde für etwa 100 Tage bis zum Abrufen der Transplantate ( Abbildung 3D ) aufrechterhalten. Die geladenen Inselchen wurden gleichmäßig auf DCS verteilt und von EFP abgedeckt. Das mit der Insel beladene DCS konnte auch mit Pinzette leicht gehandhabt werden ( Abbildung 3E und 3F ). Die histologische Studie zeigte, dass die gleichmäßig verteilten Inseln revaskularisiert und von dem EFP-Gewebe und dem DCS nach der Transplantation für 60 Tage umgeben wurden ( Abbildung 3G ). Die Immunfärbung von Insulin bestätigte ferner die erfolgreiche Einlagerung der Inselchen ( Abbildung 3H ). Deutsch - Englisch - Übersetzung - Linguee Abbildung 3: Transplantation von Gerüst-gestützten Inseln zum EFP-Standort. ( A ) Repräsentatives Bild von frischen Inseln, die von Mäusen isoliert wurden. ( B ) Islets kultiviert für 12 h, wobei tote Zellen von der Inseloberfläche abschleifen. Inset: ungesunde Inselchen haben einen dunklen, nekrotischen Kern. ( C ) Größenverteilung von 945 Inseln von 5 Mäusen. ( D ) Nicht-fastender Blutzuckerwert der diabetischen Mäuse, die mit DCS-gestützten Inseln und freien Inselchen transplantiert wurden. Der schwarze Pfeil zeigt an, dass das Transplantat zu diesem Zeitpunkt abgerufen wurde. ( E ) Foto, das die Übertragung von islet-beladenem Gerüst auf die Oberfläche eines verbreiteten EFP-Gewebes zeigt. ( F ) Repräsentatives Phasenkontrastbild der islet-beladenen DCS. Inset: optisches Bild des DCS, gehalten durch Pinzette. ( G ) Repräsentatives histologisches H &amp; E - Bild derTransplantierte Inseln, umgeben von DCS und EFP, nach 60 Tagen. ( H ) Immunfärbung der DCS-gestützten Inseln, nach 60 Tagen explantiert. Maßstäbe = 150 μm (A, B), 100 μm (F), 500 μm (G) und 25 μm (H). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54995/54995fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

scaffold-supported-transplantation-islets-epididymal-fat-pad-diabetic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.0K Aufrufe.  Peking University.  Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand. 

Serie: Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Forschung

Medizin

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Biologie

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Biotechnik

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the efficiency of the therapy. For transfer to the recipient body, cells often need to be combined with biomaterials, especially hydrogels. However, validation of the efficacy of such a graft requires the right environment, the right hydrogel, and the right recipient site. The omentum might be such a site. Based on the example of islet transplantation, we developed the hOMING (h-Omental Matrix Islet filliNG) technique, which consists of the injection of the graft inside the tissue, in between the omental layers, to improve islet implantation and survival. To achieve this, islets have to be embedded in a hydrogel with a viscosity that enables its injection using an atraumatic needle. Syringes are loaded with a combination of hydrogel and islets. Several injections are performed inside the omental tissue at different entry points, and the deposition of the islet/hydrogel mixture is made along a line. We tested the feasibility of this innovative approach using dextran beads. The beads were well spread throughout the omental tissue, in close proximity to blood vessels. To test the efficacy of the graft, we transplanted islets into diabetic rats and perform a metabolic follow-up over two months. The transplanted islets exhibited a high rate of re-vascularization around and inside islets, and reversed diabetes. The hOMING technique could be applicable for other types of hydrogel or cell therapy, for cells with high metabolic activity.

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG hOMING

Here, we present a protocol for in vivo validation of hydrogel-based cell therapy, illustrated by the example of islet transplantation. h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) implantation allows implantation of a cell-hydrogel mixture between the omental layers, near to blood vessels, to maximize engraftment in a proper metabolic environment.

Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Murine Model of Islet Transplantation: A Surgical Method to Infuse Pancreatic Islets in Portal Vein and Prevention of Postoperative Bleeding

Source: Gou, W. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62530">Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we describe a procedure to infuse pancreatic islet cells into the&#160;hepatic portal vein, followed by application of gel foam to successfully prevent bleeding. Postoperative bleeding is a common cause of high mortality during islet transplantation.

Mausmodell der Inseltransplantation: Eine chirurgische Methode zur Infusion von Pankreasinseln in die Pfortader und zur Vorbeugung postoperativer Blutungen

Source: Gou, W. et al. Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. (2021)
In this video, ...