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The authors have no competing financial interests.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Photobleaching: Vermeidung unzumutbarer Photobleichens fluoreszierenden Proben ist unbedingt erforderlich, um eine effiziente Durchführung der konfokalen Mikroskopie. Daher wird die Zeitproben durch das Okular zu lokalisieren oder Bildaufnahmeparameter über den Live-Abtastmodus eingestellt sollte Photobleichens minimiert werden minimiert. Gewebeschäden: Da Mitochondrien betrachtet sind die Sensoren der zellulären Gesundheit zu sein, ist es äußerst wichtig , um sicherzustellen , dass die physiologisch relevanten erhaltenen Daten , die die beschriebenen Methoden sind und spiegeln nicht die unangemessenen durch die Verfahrens Präparation der Drosophila Ovarien verursacht wurden. Die Präparation sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, sondern auch bei extremer Vorsicht zu Gewebeschäden zu minimieren. Die durchschnittliche Zeit für die Präparation und Necken von 5 Drosophila Ovarien ist 5 bis 7 min (in der Hands). Anstrengung muss Eikammern zeigt beschädigtes Gewebe zu identifizieren ergriffen werden, die aus den Analysen ausgeschlossen werden. Gewebeschäden durch Dissektion kann unnötige Lücken enthalten (* in 9A, wie durch das Fehlen des Signals identifiziert), Kerben / Tränen (* in Figur 9B gezeigt ist , wie durch das Fehlen des Signals identifiziert) oder Deformation der Eikammern (* in Figur 9C). Allerdings sollten sorgfältig ausgewertet werden jede sinnvolle Kammer Verformung aus der experimentellen Manipulation entstehen. Obwohl kein Deckglas auf dem lebenden Gewebe in dem Protokoll beschrieben, Abflachen der Ovariolen verwendet wird , kann mit unangemessenen Druck auftreten auf das Gewebe aufgebracht wird, während das Necken oder Befestigungs (* in 9D). Die Abflachung der Ovariolen hat mit festen Proben beobachtet, nicht da beschrieben das Protokoll die Fixierung von Gewebe unmittelbar nach der Sektion beinhaltet, mit teasing danach auftritt. Jede isoliert Eikammer ohne Unterschrift des aforementioned Schaden kann als normal angesehen werden. Mechanische Schäden durch Dissektion was möglicherweise auch zum Verlust der GFP führen, wodurch man falsch GFP-negativen Klone 16 und kann auch zu einer verbesserten Farbstoff Einarbeitung führen. Da die Keimbahnzellen innerhalb der Eikammern Wohnsitz sind normalerweise nicht durchlässig für den lebenden mitochondrialen Farbstoffen (6 und 7), die verbesserte mitochondriale Anfärbung der Drosophila Keimbahn - Zellen können sich aus einer Erhöhung der Permeabilität der beschädigten / sterbenden Gewebe; Ein solcher Artefakt mit dem Mito-ROS - Farbstoff (** in 9C und die gesamte Ovariole in 9D), sowie mit anderen lebenden mitochondrialen Flecken (nicht gezeigt) auftritt. Der Verlust von UbiGFP in 9D (*) könnte auch von Schäden führen, die die Abflachung der Eikammern verursacht. Obwohl andere Eikammern in der beschädigten Ovariole kann authentisch bleiben und frei (# in 9C Artefakt </strong&gt;), ist es am besten, das ganze Ovariole aus den Analysen ausgeschlossen werden. Ähnliche Schäden können auch Augmented-Zugang von Antigenen an die Antikörper in der Immunfärbungsverfahren, was zu einer signifikanten Steigerung der Immunfärbung in den beschädigten Zonen ermöglichen. Daher sollten die Eikammern mit verbesserten lebenden oder Immunofärbung im Vergleich zum Rest der Bevölkerung von den Analysen ausgeschlossen. Zeitempfindlichkeit: Im Fall von Lebend ex vivo Mikroskopie, sollten die Daten innerhalb von 15 min von Gewebebefestigungs erhalten werden; Andernfalls können die Versuchsergebnisse von Veränderungen der Physiologie der anschließenden Tod des Gewebes durch berührt. Manchmal, abhängig von der Laserleistung und andere Abtastparameter, die 10 &amp; mgr; l Befestigungsmedium kann schneller verdunsten als 15 min. Die Detektion des mitochondrialen Cyclin E-Pool durch Co-Immunfärbung erfordert die Minimierung der Dissektion Zeit (wahrscheinlich aufgrund der vorübergehenden Natur des mitochondrial Cyclin E - Pool, der durch aktive mitochondriale Atmung 12) gehalten wird. Ein nennens mitochondrialen Cyclin E-Pool wurde auch nicht mit Permeabilisierung mal weniger als 30 min beobachtet. FLIP: Die Bewegung von jedem Ei Kammer unter Prüfung während der FLIP Zeitverlauf zu artifactual Analysen führen können und somit ausgeschlossen werden müssen. Die Verwendung von Live-mitochondriale Farbstoffe oder TMRE nicht in einem FLIP-Experiment zu empfehlen, da Einbau des fremden Farbstoff die mitochondriale Kontinuität verändern können und damit zu artifiziellen Ergebnissen führen. Drosophila Kreuzung Strategie: Das Kreuz reziprok zu dem hier beschriebenen (wo Männer die DRP1 mutierten Allel verwendet werden) nicht nachgibt viele Nachkommen, wahrscheinlich aufgrund einer nicht identifizierten Auswirkungen DRP1 Repression in den heterozygoten männlichen Eltern. Interpretation von klonalen Daten: Jedes GF-negativen Klone in den Kontroll Ovarien nachgewiesenisoliert aus dem elterlichen Drosophila UbiGFP exprimieren artifactual falsch-negative Klone zeigen würde, wahrscheinlich aufgrund von GFP Verlust durch Beschädigung während der Präparation 16 verursacht erzeugt. Nichtsdestoweniger sollte die Anzahl der GFP-negativen Klonen in der Hitzeschock Nachkommen der Kreuzung deutlich höher als alle falsch-negative Klone in den Kontrollen gesehen. Die Klone in der Follikel Zellschicht Drosophila erzeugt durch die beschriebene mitotische Rekombination basierende Strategie aus den mitotischen Follikel Stammzellen entstehen (Zellklone stammen) oder aus den mitotischen nicht Stamm Follikelzellen (transient Klone). Für Stammzellklone, sollten die experimentellen Analysen nur 10 Tage nach der Hitzeschock durchgeführt werden, wenn die Eikammern mit den transienten Klone bereits gelegt worden sind. Für transiente Klone sollten die Analysen innerhalb von 6 Tagen nach dem Hitzeschock, mit den Follikel Zellklone der Ovariolen ohne Follikel Zellklon in der Germarium durchgeführt werden. Änderungen und Fehlerbehebung Während mitochondrialen Potential pro Masseneinheit der Bewertung der beschriebenen Verfahren, hat eine von der Mikroskopoptik oder mitochondriale Farbstoffkombinationen ergeben bewusst potentielle Artefakte zu sein. Jede Region ein geschwächtes Signal aus dem gesamten mitochondrialen Fleck zeigt und einen vergleichsweise erhöhten TMRE Signal (5A, *) aufgrund Fluoreszenz - Resonanzenergietransfer entstehen können (FRET) zwischen den Farbstoffen 8 oder aufgrund von unterschiedlichen optischen Eigenschaften des roten (TMRE) und grün (insgesamt mitochondrialen Farbstoff) Leuchtstoffröhren, eine feste Pinholegröße in den Erwerb Setup gegeben. Die FRET-bezogene Artefakt könnte durch eine Verringerung der Farbstoffkonzentrationen vermieden werden, wenn möglich, während quantitative Analysen auf Projektionen von 2 durchgeführt werden kann - 3 aufeinanderfolgende optische Scheiben, die optische Artefakt zu vermeiden. Auch, wenn ein Fluoreszenzsignal in dem Übersprechen und Queranregungs detektiertKanäle, müssen die Laser und Detektoreinstellungen das Signal in diesen Kanälen zu minimieren nachjustiert werden, die das Fluoreszenzsignal in den optimalen Kanäle zu reduzieren, wie auch zu erwarten ist. Laser-induzierte beschädigte aus dem iterativen Photobleichens kann mitochondriale Fragmentierung verursachen und somit die mitochondriale Diskontinuität führen, einen erfolgreichen FLIP zu verhindern. Verdacht Fragmentierung der Mitochondrien während der Ausführung des Flip-Protokoll kann durch Erfassen höher aufgelöste Bilder mit einem reduzierten Pinhole (und Verbesserung der Detektorverstärkung) identifiziert werden. Wenn die Fragmentierung der Mitochondrien sichtbar während der Ausführung des Flip-Protokoll, die Leistung des Bleich Laser muss reduziert werden und / oder das Intervall zwischen aufeinanderfolgenden Bleichmittel muß erhöht werden bemerkt wird. Wenn es insgesamt Bleich ist , muß während des Zeitverlaufs des Experiments FLIP (Signal aus dem gelben ROI in 3B und C), wobei die Scanning - Laser auf einen Wert nachjustiert werdendass ermöglicht minimale oder gar keine Gesamtphotobleaching. Um das Potenzial Artefakt aufgrund einer Schädigung induzierten Verlust von GFP, GFP-positive Klone vermeiden können mit der MARCM Strategie eingeführt werden, nach dem beschriebenen Hitzeschock-Protokoll. Hier wird die entsprechende Drosophila für das Kreuz verwendet werden soll jungfräulichen weiblichen drpKG03815 FRT40A / CYO X männlich Gal80 FRT 40A / Cyo; Wanne-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. Die Geradflügel Nachkommen sollten für Klon Generation verwendet werden, unter Verwendung von Hitzeschock (wie in Schritt 6 beschrieben). Einschränkungen der Technik A) Während die Follikel Zellen auf der Oberfläche der lebenden Drosophila Eikammern beinhalten die mitochondriale Färbung Farbstoffe mit Wohnsitz versagen die Keimbahnzellen im Ei Kammer zu tun; die Keimbahn der jüngeren Stadien Fleck schwach (5 und 6). B) Die Live - ex vivo tissue - Mikroskopie muss von einzelnen Drosophila, ein zu einer Zeit isoliert auf Ovarien innerhalb von 15 Minuten nach Beendigung der Färbung durchgeführt werden. Da Versuchsgruppen und am selben Tag abzubildenden verarbeitet werden sollen, getroffen , um die Gesamtzeit statistisch signifikante Daten von lebendem Gewebe ex vivo Mikroskopie von verschiedenen Versuchsgruppen zu erhalten , ist einigermaßen länger als diejenigen , die aus festen Geweben gewonnen. C) Wir haben festgestellt , dass das Mito-ROS - Färbung in der ex vivo Drosophila Gewebe nicht sehr stabil war, wahrscheinlich aufgrund der vorübergehenden Natur des ROS Analyt es erkennt , 17,15, welche die fehlende Erkennung des Signals von allen DRP1 zugrunde liegen kann null-Klone. Jedoch kann jede biologische Relevanz der Variabilität in Mito-ROS Färbung in den DRP1 null Zellen / Klone können nicht weiter ausgeschlossen und müssen untersucht werden. Beachten Sie, dass das positive Signal von der Mito-ROS Fleck kann nicht nur verbesserte Superoxid widerspiegeln, sondern auch die erhöhte mitochondriale oder Cellular oxidativen Umgebung 15. D) Die gesamte mitochondriale stain kann nicht für die GFP-negative oder positive GFP-klonale Experimenten verwendet werden, da das Fluoreszenzspektrum dieses mitochondrialen Fleck und GFP nicht zu unterscheiden sind. E) Das FLIP - Experiment entworfen , um die mitochondriale Matrix Kontinuität Assay würde die Bildaufnahme mit einem offenen Lochblende erfordern, die die Auflösung der mitochondrialen Strukturen umfasst. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung Studium ist von entscheidender Bedeutung für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Mitochondrien-Funktionalität. Da deutlich mitochondriale Defekte zu verschiedenen Krankheiten beitragen, einschließlich Diabetes, Krebs, Parkinson-Krankheit, ein detailliertes Verständnis der mitochondrialen Vorgehensweise hält das Versprechen von Facilităţing die Entwicklung der Mitochondrien gerichtete therapeutische Strategien. Lebendzell-Mikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug, um die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung für das Studium. Jedoch wurden in isolierten Zellen den meisten dieser Studien beschränkt. Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion wurde erweitert , 9 Drosophila Gewebe in einem ex vivo - Setup zu leben. Das beschriebene Protokoll dieser und verwandter Studien werden in lebenden Drosophila Ovarien zu einem Verständnis der mitochondrialen Struktur und Funktion führen, ex vivo, ein Verständnis der Mitochondrien in einer physiologischen Kontext zu ermöglichen. Diese ex vivo Ansatz hat signifikante Vorteile gegenüber in vitro Studien, da die Regelung der metabolischen und energetischen Eigenschaften der Mitochondrien in einer gegebenen Zelle auf die Nährstoffverfügbarkeit und entsprechende Signalisierung im physiologischen Kontext der Zellen stark abhängig ist. Genetic manipulation of mitochondrial Struktur durch die mitochondrialen Protein Spaltungs DRP1 reprimierenden dereguliert den Zellzyklus - Modulator Cyclin E und wirkt sich auf die Entwicklung der Drosophila Ovarialfollikel Zellschicht 9,12. Hier enthält das Protokoll eine Beschreibung, wie die Einführung funktionell null Klone von DRP1 in den Drosophila Ovarien die mitochondriale Struktur-Funktions - Beziehung zu studieren. Ein neuer Pool von mitochondrialen Cyclin E auf Säugerzellen, wie auch die Drosophila Follikelzellen Schicht 12 erfolgreich erkannt wurde, die wahrscheinlich die gemeldete Cyclin E Regulation durch Mitochondrien zugrunde 18. Hier zeigt das Manuskript ein Verfahren zum Nachweis des neuartigen mitochondrialen Cyclin E - Pool durch Co-Immunfärbung festen Drosophila Ovarien für dCyclinE und einem mitochondrialen Marker (ATP-B). Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering Da tHut Drosophila melanogaster eine leistungsfähige genetische Modellsystem ist, sind unsere beschriebenen Methoden erwartet wesentlich zum Verständnis der genetischen Grundlage der mitochondrialen Struktur-Funktions - Beziehung in Gesundheit und Krankheit beitragen. Drosophila wurde führende die genetischen Wechselwirkungen herauszukitzeln tumorigenesis 19 weit verbreitet. Die Fähigkeit der Erzeugung von Klonen in der epithelialen Zellschicht Follikel Drosophila ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkung von Mitochondrien und Onkogenen oder Tumorsuppressoren in einzelnen tumorigenen Klone in eine in vivo und ex vivo - Setup. Die beschriebenen Verfahren können aus geeigneten mutanten Drosophila isoliert die Regulation der mitochondrialen Struktur-Funktions - Beziehung auf Ovarien zu studieren verwendet werden. Die beschriebenen Verfahren kann weiterhin die direkten Auswirkungen verschiedener Nähr- und Wachstumsfaktor zu studieren erweitert werden Signalisierung auf die mitochondriale Struktur und Funktion durch die exogenous Zugabe der entsprechenden Nährstoffe und / oder Wachstumsfaktoren in der ex vivo Abbildungsmedium. Die beschriebenen Verfahren können in geeigneter Weise in anderen isolierten Drosophila Gewebe modifiziert und verwendet werden, wie die Larven Imaginalscheiben, die weit verbreitet verwendet wurden Signaltransduktionswege in Krankheiten wie Krebs 20,21 zu studieren.

Die Mitochondrien sind klassisch als zelluläre Kraftwerk beschrieben, da sie die Haupt Sitze der Energieproduktion in differenzierten Zellen sind. Darüber hinaus spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, Wärmeerzeugung, Lipid - Modifikation, Calcium und Redoxhomöostase, die Orchestrierung von Zellsignalprozesse, etc 1. Mitochondria auch eine aktive Rolle bei der Induktion von Zelltod 2, sowie in der Zellzyklusregulation 3 spielen. Solche Multifunktionalität ergeben sich folgende grundlegende Fragen: a) Wie Mitochondrien führen alle diese Funktionen gleichzeitig und b) gibt es spezifische mitochondriale Pools oder Subzonen, die für verschiedene Funktionen spezialisiert sind? In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die multifunktionale Mitochondrien in ihrer Form, Größe und Struktur innerhalb einzelner Zellen und dass die Beharrungsform der Mitochondrien variieren zwischen Zelltypen können dynamisch sind zu beachten. Jahrzehnte der Forschung aus verschiedenen LaborOratorien legen nahe , dass die Änderung der mitochondrialen Form, Größe und Struktur, die kollektiv mitochondrialen Dynamik genannt, entscheidend ist 4,5,6 verschiedenen mitochondrialen Funktionen aufrechtzuerhalten. Diese Ergebnisse heben die Möglichkeit, dass die Mitochondrien ihre Multifunktionalität, die aufgrund ihrer strukturellen Dynamik erreichen kann. Umfangreiche Anstrengungen unternommen werden, die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung zu verstehen. Die Dynamik der mitochondrialen Struktur wird durch ihre Fähigkeit zu unterziehen Spaltung und Fusion Ereignisse miteinander in erster Linie beibehalten. Fission von großen Mitochondrien wandelt sie in kleinere mitochondrialen Elemente, während Fusion zwischen zwei kleineren Mitochondrien führt diese in ein größeres mitochondrialen Element 7. Außerdem kann transient Fusion von zwei Mitochondrien auftreten, um die Vermischung von deren Inhalt zu ermöglichen. Die Spaltung und Fusion Ereignisse der inneren und der äußeren mitochondrialen Membranen werden sorgfältig durch spec geregeltific setzt von Proteinen. Die Kernspaltung Maschinen ist dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) aus, der aus dem Cytosol in die Mitochondrien durch seine Wechselwirkung mit bestimmten bona fide mitochondriale Proteine (zB Fis1 oder MFF1) eingestellt wird, während DRP1 Funktion auch reguliert werden kann durch andere Proteine auf der mitochondrialen Oberfläche 4. Obwohl DRP1 auf der äußeren Membran arbeitet, beeinflussen seine Spaltung Fähigkeiten, um die innere Membran als auch. Die Orchestrierung der Spaltung von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen ist nicht gut verstanden. Auf der anderen Seite, die Fusion der inneren Membran wird im Kern durch die Aktivitäten der opA1 geregelt, während mitofusins die Fusion der äußeren Membran 5 regieren. Der Rest der entgegen Spaltung und Fusion Ereignisse der Mitochondrien diktieren die Steady-State-mitochondriale Form in einer Zelle. Zum Beispiel würde Unterdrückung der mitochondrialen Spaltung in vollständig und ohne Widerstand Fusion, während die Überaktivität der Mitochondrienl Spaltung würde zu einer Fragmentierung der Mitochondrien 3 führen. Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung geht es vor allem zwei komplementäre Ansätze: a) Analyse der zellulären und organismischen Phänotypen nach genetischen Manipulation von mitochondrialen Spaltung / Fusionsproteine ​​und b) die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion. Es ist bemerkenswert, dass genetische Analysen nicht immer die direkte Funktionalität des Moleküls an der Hand (in diesem Fall die mitochondriale Spaltung / Fusionsproteine) kann sich herausstellen, wie die Phänotypen aufgrund Nebenwirkungen auftreten können. Daher ist es von größter Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln und zu verwenden, um direkt mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen. Bei der Beurteilung der mitochondrialen Struktur beinhaltet verschiedene Mikroskopie-Tools. Die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen fortgeschritten ist stark, die Studien der mitochondrialen Dynamik, da die mitochondriale Dynamik überwacht werden können, sowohl qualitativ als auch quantitathungsweise die entsprechenden Fluoreszenzmikroskopie Werkzeuge und Techniken unter Verwendung von 8. Die Fluoreszenzmikroskopie-basierte Werkzeuge wurden mitochondriale Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila melanogaster Gewebe zu studieren entwickelt, die Aufklärung der Bedeutung der mitochondrialen Dynamik in vivo 9. Diese und verwandte Verfahren werden hier beschrieben, mit dem Ziel , mitochondriale Struktur studieren und Funktion in der Drosophila Ovars. Das Drosophila Ovar besteht aus Keimbahn und somatischen Abstammungslinien, die von ihren jeweiligen adulten Stammzellen entstehen , die 10,11 in der Germarium befinden. Sechzehn - Syncytial - Keimzellen (GCs) durch somatische Follikelzellen eingekapselt erhalten (FCs) einzelne Ei Kammern zu bilden , die aus dem Germarium (Abbildung 1) entstehen. Eines der 16 GCs eine Eizelle zu werden erhalten begangen, und die restlichen 15 GCs in Nährzellen entwickeln, die das Wachstum der Eizelle Kammer unterstützen, Die Reifung der Eizelle zu erleichtern, bevor sie verlegt wird. Die Mehrzahl der FCs laufen 9 Runden von Mitosen, bevor sie den mitotischen Zellzyklus verlassen terminal mit in einer strukturierten Epithelzellschicht unterscheiden, bestehend aus vorderen Follikelzellen (AFCs) posterior Follikelzellen (PFCs) und Hauptkörperzellen (MBCs) . Die aufeinander folgenden Ei Kammern sind durch Stengel Zellen verbunden, die Zellen unterschieden, die auch von den FCs früh in der Entwicklung ableiten. Mitochondriale Form durch die DRP1 mitochondrialen Spalt Protein reguliert wird im Prozess der Differenzierung während der normalen Entwicklung des Drosophila ovarian FC Schicht 9,12 beteiligt. Die Verfahren , die in diesen Studien verwendet , um die Beteiligung von DRP1 in Drosophila Follikel Zellschicht Entwicklung zu identifizieren , werden hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Grace&#039;s Media (Insect Dissecting Medium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyde AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>MitoSox (Mito-Ros stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antibody (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&amp;nbsp;Glass Bottom Mircrowell Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Active Dried Yeast</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Macro Zoom Microscope</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono&amp;nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying mitochondrial structure and function in drosophila ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

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Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in Drosophila-Eierstöcken | Biologie | Video

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

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Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

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23.9K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham. Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper. 

Serie: Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Forschung

Genetik

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Entwicklungsbiologie

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochemie

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Verhalten

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Biologie

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Analyse der mitochondrialen Physiologie und Bioenergetik bei Fruchtfliegen

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy metabolism with impairment of mitochondrial functions. Mitochondria are organelles that control both energy metabolism and cellular processes involved in cell survival and death. For this reason, approaches to evaluate mitochondrial function can offer important insights into cellular conditions in pathological and physiological processes. In this regard, high-resolution respirometry (HRR) protocols allow evaluation of the whole mitochondrial respiratory chain function or the activity of specific mitochondrial complexes. Furthermore, studying mitochondrial physiology and bioenergetics requires genetically and experimentally tractable models such as Drosophila melanogaster.
This model presents several advantages, such as its similarity to human physiology, its rapid life cycle, easy maintenance, cost-effectiveness, high throughput capabilities, and a minimized number of ethical concerns. These attributes collectively establish it as an invaluable tool for dissecting complex cellular processes. The present work explains how to analyze mitochondrial function using the Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. The pink1 gene is responsible for encoding PTEN-induced putative kinase 1, through a process recognized as mitophagy, which is crucial for the removal of dysfunctional mitochondria from the mitochondrial network. Mutations in this gene have been associated with an autosomal recessive early-onset familial form of PD. This model can be used to study mitochondrial dysfunction involved in the pathophysiology of PD.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der mitochondrialen Funktion und chemischen Toxizität mit Drosophila melanogaster 

Here we present a high-resolution respirometry protocol to analyze bioenergetics in PINK1B9-null mutant fruit flies. The method uses the Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) protocol.

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in

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In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie