Name: measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
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Diese Studie wurde finanziert durch Zuschüsse aus dem National Sciences und Engineering Research Council (NSERC, Entdeckung Grant) und Université de Moncton, NP. LHB möchte die finanzielle Unterstützung des Canadian Institute of Health Research (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) und der Université de Moncton anerkennen. Die Arbeit des EHC wird von der Université de Moncton und Alzheimer Gesellschaft des Gehirns Kanada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, Kanada, New Brunswick Health Research Foundation unterstützt.

(1) Reagenzien Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Dissektion und Permeabilisierung des Gewebes.<ol>
<li>Bereiten Sie Erhaltung Lösung: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, Taurin, 20 mM 15 mM Na2Phosphokreatin, 20 mM Imidazol, 0,5 mM Dithiothreitol, und 50 mM K-MES, pH 7,1 (kann gespeichert werden bei-20 ° C).</li>
		<li>Bereiten Sie Saponin Lösung: 5 mg Saponin in 1 mL der Bewahrung Lösung (bereiten Sie täglich frisch).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie folgenden Lösungen für die Messung der Atmung.<ol>
<li>Bereiten Sie Atmung Medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2und 0,2 % BSA (w/V), pH 7,2.</li>
		<li>Entkuppler, Substrate, Inhibitoren vorzubereiten. Lösen Sie alle Substrate in H2O und lösen Sie der Entkuppler FCCP sowie die Inhibitoren in Ethanol absolut (mit Ausnahme von malonat die H2O verdünnt ist auf). Die meisten der Substrate sowie malonat (siehe Tabelle der Materialien) zu neutralisieren. Alle Konzentrationen im Protokoll gegeben sind Endkonzentrationen in 2 mL Kammern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung und Kalibrierung von hochauflösenden Respirometer.
<ol><li>Die Kammern, Kappen und Stopfen der Respirometer dreimal mit 70 % Ethanol und dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen.</li>
	<li>Kalibrieren auf NULL Sauerstoffkonzentration: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern und 10 mg Natrium Dithionite hinzufügen. Zwar das maximale Volumen der Kammer 2 mL, 2,3 mL hinzugefügt, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter der Stopper bleibt, wenn die Kammern zu schließen. Schließen Sie die Kammern mit den Stöpseln und Messen Sie der Sauerstoffkonzentration für 10-20 min. kalibrieren die Elektroden bei Null Sauerstoffkonzentration mit der daraus resultierenden Sauerstoff-Verbrauch zu.</li>
	<li>Die Kammern mit distillated Wasser zu waschen, in absoluten Ethanol für 10 min inkubieren, und dann mit destilliertem Wasser abspülen.</li>
	<li>Bei Sättigung der Luft kalibrieren: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern, legen Sie die Stopper, Aspirieren Sie das überschüssige Medium auf die Stopper und heben Sie dann die Stopper mit Abstandhalter. Überschüssige Atmung Medium ist in den Kammern (Volumen von 2 mL gesamt) pipettiert, um das Vorhandensein von Luftblasen zu vermeiden, nach dem Schließen der Kammern.</li>
	<li>Überwachen den Sauerstoffverbrauch für 45 Minuten bis eine Stunde, bis der Sauerstoff-Konzentration (blaue Spur) stabil rund 250 ist nM bei 24 ° C.</li>
</ol>(3) sezieren von fliegen und Permeabilisierung der Gewebe
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Schritte ausgeführt werden, auf dem Eis.</li>
	<li>Betäuben sechs männlichen fliegen von dem gleichen Stamm, dasselbe Alter und auf die gleiche Diät auf Eis, Dissektion der fliegen zu erleichtern (Wildtyp w1118, 15 Tage alt, mit Maismehl Medium gefüttert) erhoben.</li>
	<li>Mit einem Skalpell und feine Spitzen Pinzette, sezieren Sie die fliegen (entfernen Sie die Köpfe und Bäuche) um nur des Thoraxes, enthält die Flugmuskeln zu halten. Dieser Schritt kann mit dem bloßen Auge erfolgen. Die daraus resultierende Thoraxes mit feinen Spitzen Pinzette zu behandeln.</li>
	<li>Drei seziert Thoraxes in einem 25 mm Petrischale mit 2 mL eiskaltes Bewahrung Lösung mit der Pinzette zu übertragen.</li>
	<li>Mit der feinen Spitze Pinzette mechanisch permeabilize des Thoraxes durch Einfügen von der Spitze der Zange in die Thoraxes und wiederholt zerreißen des Gewebes um ein locker verbundenes Netzwerk zu erhalten.</li>
	<li>Füllen Sie in einer 24-Well-Platte zwei Brunnen mit 12,5 µL der Saponin-Lösung und 1 mL der Bewahrung Lösung um eine Endkonzentration von 62,5 µg/mL von Saponin zu erhalten. Füllen Sie die zwei benachbarten Brunnen mit 1 mL der Atmung Medium.</li>
	<li>Mit der feinen Spitze Pinzette drei permeabilized Thoraxes in die verdünnte Saponin-Lösung und mit milden Agitation auf einem Orbitalschüttler auf Eis, für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der zweiten Inkubation die Fasern in die benachbarten Vertiefungen gefüllt mit der Atmung Medium mit milden Agitation, auf Eis, für 5 min die Saponin abzuspülen.</li>
</ol>4. Bestimmung der Trockenmasse
<ol><li>Trocknen Sie der permeabilized Thoraxes auf einer saugfähigen Unterlage und drehen Sie 3-4 mal mit der feinen Spitze Pinzette um sicherzustellen, dass alle Feuchtigkeit entfernt wird.</li>
	<li>Wiegen Sie die drei Thoraxes auf einer Mikrowaage zusammen. Beachten Sie die erhaltenen Gewicht, wie es verwendet wird, um die mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch zu normalisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe sofort in einem Tropfen Atmung Medium auf Eis.</li>
</ol>(5) Sauerstoff Verbrauch Rate Bestimmung
<ol><li>Öffnen Sie die Kammern der Respirometer (entfernen Sie die stopfen) und fügen Sie 10 mM von Pyruvat und 2 mM von Malate in jeder Kammer.</li>
	<li>Fügen Sie die permeabilized Gewebe direkt in die Kammern, die mit der Atmung Medium gefüllt.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Stopper mit Abstandhalter.</li>
	<li>Mit einer Spritze 60 mL sammeln Sie Sauerstoff direkt aus einer Sauerstoffflasche zu und Spritzen Sie 2-5 mL Sauerstoff durch die Stopper Kapillare jeder Kammer um sicherzustellen, dass Sauerstoffdiffusion durch das Gewebe nicht Sauerstoffverbrauch beschränkt wird.</li>
	<li>Einsetzen Sie eine Hamilton-Spritze in der Kapillare von jedem Anschlag um sicherzustellen, dass die Thoraxes in der Kammer verbleiben.</li>
	<li>Die Kammern vollständig zu schließen, wenn die Sauerstoffkonzentration rund 400 beträgt nM, Sauerstoffgehalt über Luft Sättigung zu erreichen (etwa 160 % Luft Sättigung) in den Kammern.</li>
	<li>Beenden Sie und starten Sie den Rührer für Luftblasen in den Kammern zu überprüfen.</li>
	<li>Geben Sie die Masse von Gewebe vorher gewogen, um die Atmung durch die Masse von Gewebe (mg), Anzeige Massenspezifische Sauerstoffverbrauch (Pmol O2 consumed.s-1.mg-1 des Gewebes) normalisieren.</li>
	<li>Sobald der Sauerstoffverbrauch (rote Spur) stabilisiert wird, fügen Sie 5 mM ADP mit einer Hamilton-Spritze.</li>
	<li>Spülen Sie nach jeder Injektion Spritzen mit destilliertem Wasser, 70 % Ethanol, und destilliertem Wasser wieder.</li>
	<li>Sobald der Sauerstoffverbrauch wieder stabil ist, injizieren Sie 5 µL einer 4 mm von Cytochrom c.</li>
	<li>Gehen Sie zu den sequentiellen Injektionen der folgenden Substrate, die mitochondriale Sauerstoffverbrauch auf verschiedenen Stufen des ETS zu bewerten:<ol>
<li>5 µL von einer 2 M Proline hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL einer 1 M-Succinat.</li>
		<li>Fügen Sie 30 µL einer 1 M Glycerin-3-Phosphat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren der Entkuppler FCCP in gewissem Sinne Titration in Schritten von 0,5-1 µm (2 µL einer 1 mM Lösung) bis die optimale Konzentration erreicht, d. h., die Konzentration, den höchsten Sauerstoffverbrauch möglich ohne Hemmung zu erreichen (Vorsicht: siehe Tabelle Materialien).</li>
	<li>Injizieren der folgende Hemmnisse gegenüber dem Vorquartal um vollständig hemmen das Elektron Flussmittel in der ETS um den Restsauerstoff Verbrauch (ROX) messen also nicht-respiratorischen Reaktionen wie Cyclooxygenase Reaktionen unter anderem:<ol>
<li>1 µL einer 1 mM Rotenon hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>5 µL von einer 2 M malonat hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL einer 5 mM Antimycin A (Achtung: siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 0,2 mM Ascorbat und 0,5 mM TMPD nacheinander in die Kammern beginnend mit Ascorbat, den Sauerstoffverbrauch von Komplex IV zu messen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mM von Natriumazid Komplex IV hemmen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Sobald das Signal stabil ist, die Kammern mit Abstandhalter, wieder mit Sauerstoff die Kammern durch die Injektion von 2 mL reinem Sauerstoff bei öffnen und Schließen der Kammern ist die Konzentration um 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Das Signal für 10-15 min zu messen und chemischen Hintergrund, d. h. den Sauerstoffverbrauch durch Autoxidation TMPD zu berechnen.</li>
</ol>6. Reinigung der Respirometer
<ol><li>Nach den Messungen einmal spülen Sie die Kammern mit destilliertem Wasser und spülen Sie die Kammern dreimal in 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Brüten Sie in absoluten Ethanol für 10 min, die Inhibitoren zu inaktivieren.</li>
	<li>Spülen Sie drei Mal mit destilliertem Wasser, füllen Sie die Kammern mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie die stopfen und die Kappen bis zum nächsten Einsatz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stephenson, R., Metcalfe, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+fly+through+its+history+and+current+use.">Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use.</a> The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+attempt+to+analyze+the+constitution+of+the+chromosomes+on+the+basis+of+sex-limited+inheritance+in+Drosophila.">An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila.</a> Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).</li><li>Dobzhansky, T., Wright, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Natural+Populations.+V.+Relations+between+Mutation+Rate+and+Accumulation+of+Lethals+in+Populations+of+Drosophila+Pseudoobscura.">Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura.</a> Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).</li><li>Zipursky, S. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Neuronal+Cell+Fate:+Lessons+from+the+R7+Neuron+of+Drosophila.">Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).</li><li>Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+therapeutic+potential+of+doxycycline+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer+disease.">Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease.</a> The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).</li><li>Blandini, F., Armentero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Parkinson's+disease.">Animal models of Parkinson's disease.</a> FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).</li><li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+Larvae+and+Obese+Flies-Emerging+Studies+of+Metabolism+in+Drosophila.">Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).</li><li>Morris, S. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).</li><li>Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+insights+of+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+mitochondrial+damage:+importance+in+non-SOD1+ALS.">Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).</li><li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+oxidants,+and+aging.">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120 (4), 483-495 (2005).</li><li>Szibor, M., Holtz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ageing.">Mitochondrial ageing.</a> Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>L&#243;pez-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+and+healthy+aging.">Mitochondrial biogenesis and healthy aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).</li><li>Muoio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inflexibility:+When+mitochondrial+indecision+leads+to+metabolic+gridlock.">Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock.</a> Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).</li><li>Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-sensing+mechanisms+and+pathways.">Nutrient-sensing mechanisms and pathways.</a> Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).</li><li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells.">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).</li><li>McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Alternative&amp;#34;+fuels+contributing+to+mitochondrial+electron+transport:+Importance+of+non-classical+pathways+in+the+diversity+of+animal+metabolism.">&amp;#34;Alternative&amp;#34; fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).</li><li>Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Physiology+in+the+Major+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti:+Substrate+Preferences+and+Sexual+Differences+Define+Respiratory+Capacity+and+Superoxide+Production.">Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).</li><li>Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+substrate+specificity+in+beetle+flight+muscle:+assessing+respiratory+oxygen+flux+in+small+samples+from+Dermestes+maculatus+and+Tenebrio+molitor.">Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor.</a> Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).</li><li>Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+as+a+fuel+for+insect+flight:+enhancing+carbohydrate+oxidation+in+hymenopterans.">Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).</li><li>Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decline+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport+in+Drosophila+melanogaster.">Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster.</a> The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+of+superoxide+production+by+complex+III+and+glycerol+3-phosphate+dehydrogenase+in+Drosophila+mitochondria.">The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).</li><li>Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympatric+Drosophila+simulans+flies+with+distinct+mtDNA+show+difference+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport.">Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+superoxide+production+from+different+sites+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).</li><li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: isolation, structure and function.</a> The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+sensitivity+of+mitochondrial+functions+in+permeabilized+muscle+fibers+from+two+populations+of+Drosophila+simulans+with+divergent+mitotypes.">Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).</li><li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial+dna+haplotypes+exhibit+metabolic+differences:+insight+into+functional+properties+of+mitochondria.">Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria.</a> Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).</li><li>Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+influences+the+intake+target+and+mitochondrial+functions+of+Drosophila+melanogaster+males.">Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males.</a> Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).</li><li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., C&#244;t&#233;, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation:+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies.">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+proline,+a+stress+substrate,+modulates+carcinogenic+pathways.">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li><li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease:+To+carry+or+not+to+carry?.">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion.">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie wird ein Verfahren zur Probenaufbereitung vor den Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, um verschiedene Probleme im Zusammenhang mit der Protokolle, die mit mitochondrialen Isolationen, insbesondere im Hinblick auf Dauer und Anzahl der Personen erforderlich. Anstatt zu arbeiten mit mitochondrialen Isolationen, erfordern in der Regel große Menge an Gewebe aus mehreren Personen gewonnen, erfolgt dieses Experiment permeabilized Muskelfa...

Der Taufliege Drosophila Melanogaster, dient als Modellorganismus für genetische Forschung für über ein Jahrhundert1. Die Studie dieses Organismus führte nicht nur zu erheblichen Grundlagenwissen über geschlechtsgebundene Vererbung2, Mutation Satz3, die Entwicklung des Nervensystems und die Zelle Schicksal Bestimmung4, sondern hat auch vor kurzem entstanden, als ein wertvolles Instrument, um die Mechanismen, die verschiedene Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson5,6zu studieren. Darüber hinaus ist es ein beliebtes Modell, den Alterungsprozess zu studieren, da sie in großer Zahl über einen kurzen Zeitraum hinweg angehoben werden können und eine kurze Lebensdauer haben. Sie besitzen auch homologe Strukturen menschlicher Organe, wie Herz, Oenocytes (Hepatozyten-ähnliche Zellen), Fett Körper (funktionieren ähnlich wie die Leber und weißen Fettgewebe), Insulin produzierenden Zellen (β-Pankreaszellen entspricht), sowie die Hämolymphe Transport von Metaboliten (analog zu dem Blut der Wirbeltiere)7. Darüber hinaus sind die zentralen Bahnen des intermediären Stoffwechsels (einschließlich Insulin/Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-ähnliche Signalweg und Target of Rapamycin-TOR Wege) auch hoch konservierte7. Aus diesen Gründen Drosophila haben vor kurzem wurde ausgenutzt, um die grundlegenden Mechanismen zu beschreiben, die Stoffwechsel, vor allem in pathologischen Zuständen inhärenten menschlichen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes8steuern. Ein wichtiger Bestandteil des Stoffwechsels ist das Mitochondrium, das mehrere Wege integriert und führt eine der wichtigsten biologischen Lebensfunktionen, ATP-Produktion über die Oxidative Phosphorylierung-Verfahren (OXPHOS). Angesichts ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel des Organismus ist es nicht verwunderlich, dass die mitochondriale Funktionsstörungen bei vielen Erkrankungen wie Parkinson9 und Alzheimer Erkrankungen10sowie Amyotrophe Lateralsklerose beteiligt sind 11 , 12. sie sind auch wesentliche Determinanten des Alterungsprozesses. In der Tat sind die Hauptproduzenten von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, die auf die Zelle in hoher Konzentration durch oxidativen Schäden11nachteilig sein kann. Alterung wurde auch die Anhäufung von beschädigten oder mutierte mitochondriale DNA-13, Mitophagy Dysfunktionen14,15 , sowie Beeinträchtigung der mitochondrialen Biogenese16gebracht. Mitochondrien sind ebenfalls wichtige Determinanten der Homöostase der Zelle, wie sie verschiedene Substrate anpassen verschiedene Zellfunktionen entsprechend der Fülle oder Mangel an Makronährstoffen17,18nutzen können.
In der Tat sind die verschiedenen Nährstoffe in der Nahrung (Kohlenhydrate, Lipide und Proteine) verdaut, absorbiert und in die Zellen transportiert. Sie werden dann umgewandelt in das Zytosol, und die abgeleitete Substrate werden in der mitochondrialen Matrix, wo sie reduzierende Mittel, wie NADH und FADH219 produzieren,transportiert. Diese Verringerung äquivalente werden dann von verschiedenen enzymatischen komplexen Elektronentransport-System (ETS) oxidiert. Diese komplexe sind eingebettet in die mitochondriale innere Membran, wie Komplex I und Komplex II. Darüber hinaus vertreten anderen enzymatischen komplexe wie die mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase und Prolin Dehydrogenase alternative Routen für die Eingabe von Elektronen in die ETS-20,-21. Diese "alternative" komplexe sind besonders wichtig bei Insekten, können als je nach Tierart, sie aktiv um die Atmung20,22,23,21zu erhöhen. Elektronen aus diesen ETS Zuführsysteme werden das Ubiquinon und anschließend zum Komplex III und dann Komplex IV, bis die endgültigen Akzeptor, molekularen Sauerstoff übertragen. Diese Elektronentransfer erzeugt eine Kraft, Proton-Motiv auf der inneren mitochondrialen Membran fahren die Phosphorylierung von ADP zu ATP bei komplexen V (Abbildung 1). Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle der Mitochondrien in der Zelle Homöostase, mitochondrialen Stoffwechsel mit der relevanten Modell D. Melanogaster stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, die zugrunde liegenden Mechanismen der verschiedenen abzugrenzen pathophysiologischen Bedingungen oder unter Mobilfunk und Umwelt betont. Überraschend jedoch nur eine Handvoll Studien gemessen tatsächlich mitochondriale Atmung in Drosophila24,25,26. Tatsächlich erfordern Experimente mit dem Ziel, mitochondriale Sauerstoffverbrauch bewerten die Isolation von Mitochondrien. Obwohl für die Messung der verschiedenen mitochondriale Funktionen (z. B. ROS-Produktion oder P/O Verhältnis als Marker der mitochondrialen Effizienz27,28) vorteilhaft, erfordern diese Isolationen in der Regel ziemlich große Mengen Gewebe aus mehreren Individuen24,29. Diese Anforderung für hohe Mengen von Gewebe und Einzelpersonen ist ein wichtiger begrenzende Faktor, besonders wenn man bedenkt, dass alle Personen, die im gleichen Alter sein sollte und vorzugsweise des gleichen Geschlechts für die Experimente machen das Maß der Atmung zu anderen Zeitpunkt am besten verweist mühsam. Darüber hinaus während mitochondriale Isolationen bedeutenden Einblick in die grundlegenden Mechanismen mitochondrialen Stoffwechsel zur Verfügung stellen können, haben die Methoden verwendet, um die Mitochondrien isolieren einige Nachteile wie die Schwierigkeit, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen , Störungen der mitochondrialen Netz- und Veränderung der mitochondrialen Struktur und Funktion29,30,31.
Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila mit nur eine minimale Menge an Gewebe aus sehr wenige Individuen zu präsentieren. Dieses Protokoll besteht aus mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Messen in Situ mit permeabilized Muskelfasern29 von Drosophila Thoraxes in Kombination mit hochauflösender respirometrie32,33, 34 , 35. diese Methode hat auch weitere Vorteile im Vergleich zu den klassischen mitochondriale Isolationsmethode da die Interaktionen mit den anderen Komponenten der Zelle als auch mitochondrialen Struktur und Funktion in mehr konserviert werden permeabilized Fasern29,31,36, wodurch dieser Ansatz mehr physiologisch relevanten. Mit diesem Protokoll können mitochondriale Funktionen genau mit hochauflösender respirometrie in nur drei Thoraxes von Drosophila, mit Substraten ermöglicht die Bestimmung der Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS ausgewertet werden. Dieses Protokoll könnte daher wichtige Fragen über die grundlegenden Mechanismen helfen, die Stoffwechsel im Zusammenhang mit vielen Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen zu steuern, unter Ausnutzung des Drosophila-Modells.
Den Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS Messen und auswerten wie verschiedene Substrate tragen zur Atmung, verschiedene Substrate (Abbildung 1), Entkuppler und Inhibitoren sind gebrauchte30 nach Permeabilisierung der der Gewebe. Insbesondere werden fortlaufende Ergänzungen von verschiedenen Substraten durchgeführt, um Regen die Einreise von Elektronen durch verschiedene komplexe des ETS. Ein Entkuppler Carbonyl Zyanid-4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), wird dann hinzugefügt, bei optimaler Konzentration, die Atmung nicht gekoppelt zu messen, d.h., die Atmung nicht Phosphorylierung stimuliert, um maximale Sauerstoff-Verbrauch. Sequentielle Hemmungen von komplexen I, II und III dann durchgeführt werden, um den Restsauerstoff-Verbrauch zu überwachen, der durch nicht-ETS-Oxidationsreaktionen ist. Zu guter Letzt Komplex IV maximal Atmung Kapazität ausgewertet werden kann, durch die Injektion von N, N, N', N, - Tetramethyl - p-Phenylendiamin (TMPD), eine künstliche Elektron Anbieter und Ascorbat. Es ist wichtig zu beachten, dass die Experimente bei 24 °C durchgeführt werden, da es die Temperatur an der die fliegen ausgelöst werden.

<table><tbody><tr><td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K respirometer kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>O2K-Titration Set&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20820-03</td><td>Hamilton syringes with different volumes&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Datlab software</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20700</td><td>Software for data acquisition and analysis&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td>&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td><td></td><td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt; wild-type w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: 24 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: 2-8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Saponin from quillaja bark</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponin&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: 2-8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pyruvate&lt;br/&gt; Storage Condition: 2-8 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malate&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Cytochrome c&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinate&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glycerol-3-phosphate&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Malonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td></tr><tr><td>Antimycin A from &lt;em&gt;Streptomyces sp&lt;/em&gt;.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;-Tetramethyl-&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&amp;nbsp; -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Ascorbate&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&amp;nbsp; -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, stellt eine aufstrebende Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels. In der Tat, Drosophila haben Strukturen, die Homolog zu menschlichen Organen, hoch konservierte Stoffwechselwege besitzen und haben eine relativ kurze Lebensdauer, die das Studium der verschiedenen grundlegenden Mechanismen in kurzer Zeit ermöglicht. Es ist jedoch verwunderlich, dass einer der Mechanismen wichtig für Zellstoffwechsel, die mitochondriale Atmung in diesem Modell nicht gründlich untersucht worden ist. Es ist wahrscheinlich, weil das Maß für die mitochondriale Atmung in Drosophila in der Regel eine sehr große Anzahl von Individuen erfordert und die erzielten Ergebnisse nicht sehr reproduzierbar sind. Hier ist eine Methode, die genaue Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch mit minimalen Mengen von Gewebe von Drosophila beschrieben. Bei dieser Methode des Thoraxes seziert und permeabilized sowohl mechanisch mit scharfen Zangen und chemisch mit Saponin, so dass verschiedene Verbindungen zu überqueren die Zellmembran und modulieren die mitochondriale Atmung. Nach Permeabilisierung wird ein Protokoll durchgeführt, um die Kapazität der verschiedenen komplexe der Elektronentransport-System (ETS), verschiedene Substrate zu oxidieren zu bewerten sowie ihre Reaktion auf einen Entkuppler und mehrere Inhibitoren. Diese Methode bietet viele Vorteile im Vergleich zu Methoden mit mitochondrialen Isolationen, wie es mehr physiologisch relevant, ist da die Mitochondrien noch mit den anderen zellulären Komponenten interagieren sind und die mitochondriale Morphologie konserviert. Darüber hinaus Probe Vorbereitungen sind schneller, und die erzielten Ergebnisse sind sehr reproduzierbar. Durch die Kombination der Vorteile von Drosophila als ein Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels bei der Auswertung der mitochondrialen Atmung, wichtige neue Erkenntnisse können werden vorgestellt, vor allem wenn die fliegen erleben verschiedene Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen.

In Abbildung 2ist eine repräsentative Spur von mitochondrialen Sauerstoffverbrauch unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls kostenfrei. Pyruvat und Malat in den Kammern zusammen mit den permeabilized Muskelfasern injiziert werden bezeichnet, die CI-LECK-Atmung, d.h.wenn der Komplex I von der ETS durch stimuliert wird die NADH produziert durch Oxidation von Pyruvat und Malat über die Tricarboxylic Säure Zyklus (CI). Während diese Atemfre...

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Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.8K Aufrufe.  Université de Moncton. In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Serie: Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Biochemie

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Verhalten

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Analyse der mitochondrialen Physiologie und Bioenergetik bei Fruchtfliegen

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy metabolism with impairment of mitochondrial functions. Mitochondria are organelles that control both energy metabolism and cellular processes involved in cell survival and death. For this reason, approaches to evaluate mitochondrial function can offer important insights into cellular conditions in pathological and physiological processes. In this regard, high-resolution respirometry (HRR) protocols allow evaluation of the whole mitochondrial respiratory chain function or the activity of specific mitochondrial complexes. Furthermore, studying mitochondrial physiology and bioenergetics requires genetically and experimentally tractable models such as Drosophila melanogaster.
This model presents several advantages, such as its similarity to human physiology, its rapid life cycle, easy maintenance, cost-effectiveness, high throughput capabilities, and a minimized number of ethical concerns. These attributes collectively establish it as an invaluable tool for dissecting complex cellular processes. The present work explains how to analyze mitochondrial function using the Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. The pink1 gene is responsible for encoding PTEN-induced putative kinase 1, through a process recognized as mitophagy, which is crucial for the removal of dysfunctional mitochondria from the mitochondrial network. Mutations in this gene have been associated with an autosomal recessive early-onset familial form of PD. This model can be used to study mitochondrial dysfunction involved in the pathophysiology of PD.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der mitochondrialen Funktion und chemischen Toxizität mit Drosophila melanogaster 

Here we present a high-resolution respirometry protocol to analyze bioenergetics in PINK1B9-null mutant fruit flies. The method uses the Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) protocol.

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Mitochondrial Functional Assessment in Brush Lizard Liver Mitochondria

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Biologie

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Zusammenfassung

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Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

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