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The authors have no competing financial interests.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Photobleaching: Prevenire indebite photobleaching dei campioni fluorescenti è assolutamente necessario per l&#39;esecuzione efficiente microscopia confocale. Pertanto, il tempo utilizzato per individuare i campioni attraverso l&#39;oculare o per impostare i parametri di acquisizione di immagini attraverso la modalità di scansione dal vivo deve essere ridotto al minimo per ridurre al minimo photobleaching. Il danno tissutale: Poiché i mitocondri sono considerati i sensori di salute cellulare, è estremamente importante assicurare che i dati ottenuti con i metodi descritti sono fisiologicamente rilevanti e non riflettono i danni indesiderati causati dal dissezione procedurale delle ovaie Drosophila. La dissezione deve essere effettuata il più rapidamente possibile, ma anche con estrema precauzione per minimizzare danni ai tessuti. Il tempo medio per la dissezione e la presa in giro di 5 Drosophila ovaie è 5-7 min (in nostra manoS). Sforzo deve essere presa per identificare camere di uova che mostrano il tessuto danneggiato che verrà esclusa dalle analisi. Il danno tissutale a causa di dissezione possono essere incompleti indebiti (* nella figura 9A, come individuati dalla mancanza di segnale), nick / lacrime (* in figura 9B, come individuati dalla mancanza di segnale), o deformazione delle camere d&#39;uovo (* nella Figura 9C). Tuttavia, qualsiasi deformazione camera significativo derivante dalla manipolazione sperimentale deve essere attentamente valutato. Sebbene non coprioggetto è utilizzato sulla parte superiore del tessuto vivo nel protocollo descritto, appiattimento dei ovarioli possono verificarsi con indebita pressione applicata al tessuto mentre giro o montare (* in Figura 9D). L&#39;appiattimento della ovarioli non è stato osservato con i campioni fissati, dal momento che il protocollo descritto comporta la fissazione di tessuti subito dopo la dissezione, con presa in giro che si verificano in seguito. Ogni camera di uovo isolato senza firme del aforementionedanni d può essere considerato normale. Danni meccanici potenzialmente derivanti da dissezione può anche portare alla perdita di GFP, producendo falsi cloni GFP-negativo di 16, e può anche dare luogo a una maggiore incorporazione colorante. Dato che le cellule germinali risiedono all&#39;interno delle camere di uova non sono normalmente permeabili ai coloranti mitocondriali vivi (figure 6 e 7), la colorazione mitocondriale aumentata delle cellule germinali di Drosophila può risultare da un aumento della permeabilità del tessuto danneggiato / morte; tale manufatto si verifica con il colorante mito-ROS (** nella Figura 9C e tutta ovariole in figura 9D), nonché con altre macchie mitocondriali vivi (non mostrato). La perdita di UbiGFP nella Figura 9D (*) potrebbe anche derivare da danni che ha causato l&#39;appiattimento delle camere uovo. Anche se altre camere d&#39;uovo nel ovariole danneggiati possono rimanere autentico e artefatto libero (# nella Figura 9C </strong&gt;), è preferibile escludere un&#39;intera ovariole dalle analisi. danni simili può anche consentire l&#39;accesso aumentata di antigeni agli anticorpi durante la procedura immunostaining, con un conseguente notevole aumento dei immunostaining nelle zone danneggiate. Pertanto, le camere di uovo con maggiore vivo o immunocolorazione in confronto al resto della popolazione dovrebbero essere esclusi dalle analisi. Sensibilità Tempo: Nel caso di vivo microscopia ex vivo, i dati devono essere ottenuti entro 15 minuti di montaggio dei tessuti; tuttavia, i risultati sperimentali possono essere influenzati da alterazioni della fisiologia causa della morte conseguente del tessuto. A volte, a seconda della potenza del laser e di altri parametri di scansione, i 10 ml di mezzo di montaggio possono evaporare prima di 15 min. La rilevazione della mitocondriale ciclina E piscina dal co-immunostaining richiede la minimizzazione del tempo dissezione (probabilmente a causa della natura transitoria del mitochondRial ciclina E piscina che è gestito da respirazione mitocondriale attivo 12). Una mitocondriale ciclina E piscina apprezzabile non è stato osservato anche con tempi di permeabilizzazione meno di 30 minuti. FLIP: Il movimento di qualsiasi camera di uovo in esame nel corso tempo FLIP può portare ad analisi artefatti e, quindi, deve essere esclusa. L&#39;uso di coloranti mitocondriali dal vivo o TMRE non è raccomandato in un esperimento di FLIP, dal momento che l&#39;incorporazione del colorante straniero può alterare la continuità mitocondriale e portare a risultati artefatti così. Drosophila strategia di attraversamento: Il reciproco croce a quello descritto qui (in cui vengono utilizzati i maschi che trasportano l&#39;allele mutante DRP1) non produce molti figli, probabilmente a causa di un impatto non identificato di DRP1 repressione nei genitori maschi eterozigoti. Interpretazione dei dati clonale: Qualsiasi cloni GF-negativi rilevati nelle ovaie di controlloisolato dal Drosophila genitori esprimendo UbiGFP indicherebbe artefatti falsi negativi cloni, probabilmente generate a causa della perdita GFP causato da danni durante la dissezione 16. Tuttavia, il numero di cloni GFP-negativo nella prole calore scioccata della croce dovrebbe essere significativamente superiore eventuali cloni falsi negativi osservati nei controlli. I cloni generati nello strato di cellule del follicolo Drosophila dalla strategia di ricombinazione basata mitotico descritto possono derivare da cellule staminali del follicolo mitotiche (staminali cloni cellulari) o dalle cellule del follicolo non-staminali mitosi (cloni transitori). Per i cloni di cellule staminali, le analisi sperimentali devono essere eseguite solo 10 giorni dopo lo shock termico, quando sono già state poste le camere d&#39;uovo con i cloni transitori. Per i cloni transitori, le analisi devono essere eseguite entro 6 giorni dopo lo shock termico, con i cloni di cellule del follicolo dei ovarioli senza alcun clone di cellule del follicolo nella germarium. Modifiche e risoluzione dei problemi Mentre la valutazione del potenziale mitocondriale per unità di massa con il metodo descritto, si deve essere consapevoli dei potenziali manufatti derivanti dal ottica microscopio o combinazioni di tintura mitocondriali. Ogni regione che mostra un segnale indebolito dalla macchia mitocondriale complessiva e un segnale TMRE relativamente elevata (Figura 5A, *) può derivare fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) tra i coloranti 8 o dovuti a differenti proprietà ottiche del rosso (TMRE) luci fluorescenti e verde (colorante mitocondriale complessivo), data una dimensione foro stenopeico fisso nel setup di acquisizione. Il manufatto FRET correlati potrebbe essere evitato riducendo le concentrazioni di colorante, se possibile, mentre le analisi quantitative possono essere eseguite sulle proiezioni di 2 - 3 fette ottici consecutivi per evitare il manufatto ottica. Inoltre, se un segnale fluorescente viene rilevato nella diafonia e cross-eccitazionei canali, le impostazioni laser e rivelatore deve essere riadattato per ridurre al minimo il segnale in questi canali, che si prevede di ridurre il segnale fluorescente nei canali ottimali pure. Indotta da laser danneggiato dal photobleaching reiterativo può causare la frammentazione mitocondriale e quindi causare discontinuità mitocondriale, impedendo un flip successo. frammentazione Sospettato di mitocondri durante l&#39;esecuzione del protocollo FLIP può essere identificato con l&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione con una pinhole ridotta (e migliorare il guadagno del rivelatore). Se la frammentazione dei mitocondri è visibilmente notato durante l&#39;esecuzione del protocollo FLIP, la potenza del laser sbiancante deve essere ridotto e / o l&#39;intervallo tra candeggianti consecutivi deve essere aumentata. Se c&#39;è sbiancamento complessiva nel corso dell&#39;esperimento, FLIP (segnale dal ROI giallo nella figura 3B e C), il laser a scansione deve essere regolato ad un livelloche permette minimo o nessun photobleaching generale. Per evitare il potenziale artefatto dovuto alla perdita danni indotti di GFP, cloni GFP-positive possono essere introdotti utilizzando la strategia MARCM, seguendo il protocollo shock termico descritto. Qui, la Drosophila appropriato da utilizzare per la croce è femmina vergine drpKG03815 FRT40A / CYO X maschile Gal80 FRT 40A / cyo; vasca-GAL4, UAS-CD8GFP / TM6 9. La progenie dritto ala deve essere utilizzato per la generazione clone utilizzando scossa di calore (come descritto al punto 6). LIMITI DELLA TECNICA A) Mentre le cellule del follicolo che risiedono sulla superficie del live camere uovo di Drosophila incorporano i coloranti colorazione mitocondriale, le cellule germinali all&#39;interno della camera di uova non riescono a farlo; linea germinale delle fasi più giovani macchia debolmente (figure 5 e 6). B) Il live ex vivo Tissue microscopia deve essere eseguita entro 15 min di completamento della colorazione sulle ovaie isolati da individuo Drosophila, uno alla volta. Dal momento che gruppi sperimentali devono essere elaborati e ripreso lo stesso giorno, il tempo totale impiegato per ottenere dati statisticamente significativi dal vivo ex vivo microscopia tessuto dai vari gruppi sperimentali è ragionevolmente più lungo di quelli ottenuti da tessuti fissati. C) Abbiamo notato che la macchia mito-ROS non era molto stabile nel tessuto ex vivo Drosophila, probabilmente a causa della natura transitoria del ROS analita rileva 17,15, che possono essere alla base della mancanza di rilevazione di segnale da tutti i DRP1 cloni nulli. Tuttavia, qualsiasi rilevanza biologica della variabilità a Mito-ROS colorazione nelle cellule nulle DRP1 / cloni non può essere esclusa e deve essere studiata ulteriormente. Si noti che il segnale positivo dalla macchia mito-ROS può non solo riflettere una maggiore superossido ma anche la maggiore mitocondriale o Cellular ambiente ossidativo 15. D) La macchia mitocondriale globale non può essere utilizzato per le GFP-negativo o GFP-positive esperimenti clonali, poiché lo spettro di fluorescenza questa macchia mitocondriale e GFP sono indistinguibili. E) L&#39;esperimento FLIP progettato per saggiare mitocondriale continuità matrice richiederebbe l&#39;acquisizione di immagini con una pinhole aperta che comprende la risoluzione delle strutture mitocondriali. Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi / Lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale è fondamentale per una conoscenza approfondita dei meccanismi di regolazione della funzionalità mitocondriale. Perché difetti mitocondriali contribuiscono in modo significativo a varie malattie, tra cui il diabete, il cancro, il morbo di Parkinson, una conoscenza dettagliata del modus operandi mitocondriale mantiene la promessa di Facilităţing lo sviluppo di strategie terapeutiche mitocondri-diretto. microscopia Live-cell è uno strumento indispensabile per lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono stati limitati a cellule isolate. Lo studio della struttura e della funzione mitocondriale è stata estesa a vivere tessuti Drosophila in un setup ex vivo 9. Il protocollo descritto di questa e relativi studi porterà ad una comprensione della struttura e della funzione mitocondriale in vivo ovaie Drosophila, ex vivo, che consente di esaminare mitocondri in un contesto fisiologico. Questo approccio ex vivo ha vantaggi significativi rispetto studi in vitro, poiché la regolazione del metabolismo e proprietà energetiche di mitocondri in una data cellula dipende in gran parte dalla disponibilità di nutrienti e di segnalazione appropriata nel contesto fisiologico delle cellule. La manipolazione genetica di miStruttura tochondrial reprimendo il mitocondriale DRP1 proteina fissione deregolamenta il modulatore ciclo cellulare ciclina E e colpisce lo sviluppo dello strato di cellule del follicolo ovarico Drosophila 9,12. Qui, il protocollo include una descrizione di come introdurre cloni funzionalmente nulli di DRP1 nelle ovaie Drosophila per studiare la relazione tra struttura e funzione mitocondriale. Un romanzo pool di mitocondriale ciclina E su cellule di mammifero, così come lo strato di cellule di Drosophila follicolo 12, è stato rilevato con successo, che probabilmente è alla base della regolazione ciclina E riportato da mitocondri 18. Qui, il manoscritto dimostra un metodo per rilevare il romanzo mitocondriale ciclina E piscina da co-immunocolorazione fisso ovaie Drosophila per dCyclinE e un marcatore mitocondriale (ATP-B). Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica t Datacappello Drosophila melanogaster è un potente sistema modello genetico, i nostri metodi descritti sono previsti per contribuire in modo significativo alla comprensione delle basi genetiche della relazione struttura-funzione mitocondriale in salute e malattia. Drosophila è stato ampiamente utilizzato per prendere in giro le interazioni genetiche che portano alla tumorigenesi 19. La capacità della generazione di cloni nello strato di cellule epiteliali del follicolo Drosophila permette lo studio dell&#39;interazione di mitocondri e oncogeni o soppressori tumorali nei singoli cloni tumorali in un in vivo ed ex vivo configurazione. I metodi descritti possono essere utilizzati per studiare la regolazione del rapporto struttura-funzione mitocondriale sulle ovaie isolati da adeguata Drosophila mutante. I metodi descritti possono essere ulteriormente estesi per studiare l&#39;impatto diretto di vari fattori nutrienti e la crescita di segnalazione sulla struttura e la funzione mitocondriale attraverso il exogendogeni aggiunta dei nutrienti appropriati e / o fattori di crescita nel medio vivo ex imaging. I metodi descritti possono essere opportunamente modificate ed impiegati in altri tessuti isolati Drosophila, come i dischi immaginali larvali, che sono stati ampiamente utilizzati per studiare trasduzione del segnale in malattie come il cancro 20,21.

I mitocondri sono classicamente descritti come la centrale elettrica cellulare, dal momento che sono le principali sedi di produzione di energia nelle cellule differenziate. Inoltre, i mitocondri hanno un ruolo fondamentale nel metabolismo, la generazione di calore, la modifica dei lipidi, calcio e redox omeostasi, l&#39;orchestrazione dei processi di segnalazione cellulare, ecc 1. I mitocondri anche svolgere un ruolo attivo nella induzione della morte cellulare 2, nonché nella regolazione del ciclo cellulare 3. Tale multifunzionalità pone le seguenti domande fondamentali: a) come fanno i mitocondri svolgono tutte queste funzioni contemporaneamente e b) ci sono piscine mitocondriali specifici o sottozone che sono specializzati per funzioni distinte? In questo contesto, è importante notare che i mitocondri multifunzionali sono dinamici nella forma, dimensioni, e la struttura all&#39;interno delle singole cellule e che la forma a regime di mitocondri possono variare tra i tipi di cellule. Decenni di ricerca provenienti da varie laboratoriooratori suggeriscono che l&#39;alterazione della forma mitocondriale, le dimensioni e la struttura, chiamati collettivamente dinamiche mitocondriali, è fondamentale per mantenere le varie funzioni mitocondriali 4,5,6. Questi risultati sollevano la possibilità che i mitocondri possano compiere la loro multifunzionalità in virtù della loro dinamismo strutturale. Ampi sforzi sono in corso per capire il rapporto struttura-funzione mitocondriale. La dinamicità della struttura mitocondriale viene mantenuta principalmente dalla loro capacità di subire eventi di fissione e fusione con l&#39;altro. Fissione di grandi mitocondri li converte in elementi mitocondriali più piccoli, mentre la fusione tra due mitocondri piccoli li fonde in un elemento mitocondriale grande 7. Inoltre, può verificarsi la fusione transitorio di due mitocondri per consentire la miscelazione del loro contenuto. La fissione e fusione eventi delle membrane mitocondriali interne ed esterne sono attentamente regolate da specificheific imposta di proteine. Il macchinario nucleo fissione è composto dynamin-related protein 1 (DRP1), che viene assunto dal citosol ai mitocondri dalla sua interazione con certa bona proteine mitocondriali fide (ad esempio, Fis1 o Mff1), mentre la funzione DRP1 può anche essere regolata altre proteine sulla superficie mitocondriale 4. Anche se DRP1 opera sulla membrana esterna, la sua capacità di fissione impatto la membrana interna pure. L&#39;orchestrazione della fissione delle membrane mitocondriali esterne ed interne non è ben compreso. D&#39;altra parte, la fusione della membrana interna è regolata al centro dalle attività di OPA1, mentre mitofusins regolano la fusione della membrana esterna 5. Il saldo dei fissione e fusione di contrasto eventi di mitocondri dettare la forma mitocondriale stato stazionario in una cella. Ad esempio, la repressione di fissione mitocondriale comporterebbe fusione completa e senza opposizione, mentre l&#39;eccessiva attività dei mitocondril fissione comporterebbe la frammentazione dei mitocondri 3. Lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale coinvolge principalmente due approcci complementari: a) analisi dei fenotipi cellulari e organismal dopo la manipolazione genetica delle proteine ​​fissione / fusione mitocondriali e b) le valutazioni diretti di struttura e funzione mitocondriale. È interessante notare che le analisi genetiche non sempre rivelare la funzionalità diretta della molecola in questione (in questo caso, mitocondriale proteine ​​fissione / fusione), come i fenotipi possono sorgere a causa di effetti secondari. Pertanto, è di fondamentale importanza per sviluppare e utilizzare strumenti per studiare la struttura e la funzione mitocondriale direttamente. Qualsiasi valutazione della struttura dei mitocondri coinvolge vari strumenti di microscopia. L&#39;uso della microscopia a fluorescenza delle cellule vive è notevolmente avanzato gli studi di dinamiche mitocondriali, dal momento che il dinamismo mitocondriale può essere controllato sia qualitativamente che Quantitätvamente utilizzando gli strumenti e le tecniche di microscopia a fluorescenza 8 appropriate. Strumenti microscopia a base di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in tessuti Drosophila melanogaster vivi e fisse, chiarire il significato di dinamismo mitocondriale in vivo 9. Questi e metodi relativi sono descritti qui, con l&#39;obiettivo di studiare la struttura e la funzione mitocondriale nelle ovaie Drosophila. L&#39;ovaio Drosophila è composto da germinali e somatiche lignaggi, che derivano dalle rispettive cellule staminali adulte che si trovano nel germarium 10,11. Sedici cellule germinali sinciziale (GCS) vengono incapsulati dalle cellule follicolari somatiche (FC) per formare singole camere d&#39;uovo che emergono dalla germarium (Figura 1). Uno dei 16 CV ottenere impegna a diventare un ovocita, e il restante 15 CV svilupparsi in cellule infermiere che supportano la crescita della camera di ovociti, Facilitando la maturazione dell&#39;uovo prima che venga deposto. La maggior parte degli FC subiscono 9 turni di divisioni mitotiche, prima di uscire dal ciclo cellulare mitotico a differenziarsi terminale in uno strato di cellule epiteliali modellato costituito da cellule anteriore follicolo (AFCS), cellule posteriore follicolo (PFC), e principali cellule del corpo (MBC) . Le camere di uova consecutivi sono collegati da cellule gambo, che si differenziano le cellule che sono anche derivati ​​da FC nelle prime fasi di sviluppo. Forma mitocondriale regolato dalla proteina DRP1 fissione mitocondriale è attivamente coinvolto nel processo di differenziazione durante il normale sviluppo del ovarico strato di FC Drosophila 9,12. I metodi utilizzati in questi studi per identificare il coinvolgimento di DRP1 in Drosophila sviluppo strato di cellule del follicolo sono descritte qui.

<table><tbody><tr><td>Grace&#039;s Media (Insect Dissecting Medium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyde AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>MitoSox (Mito-Ros stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antibody (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&amp;nbsp;Glass Bottom Mircrowell Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Active Dried Yeast</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Macro Zoom Microscope</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono&amp;nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying mitochondrial structure and function in drosophila ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

I metodi descritti possono essere utilizzati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in ovaie Drosophila vivi e fissi (Figura 2B). A condizione sono alcuni esempi di risultati attesi ottenuti con i metodi descritti. La dissezione delle ovaie Drosophila: Quando sezionato ulteriormente, gli addomi mozzate (Figura 3B) da tutta la Drosophila (figura 3A) dovrebbero rilasciare il contenuto addominale, di cui 2 ovaie da ogni singolo Drosophila. Le ovaie intatte appaiono come ovali, strutture bianche (frecce in Figura 3C e D) che idealmente dovrebbe rimanere attaccati l&#39;uno all&#39;altro attraverso il gambo tubarico. Le ovarioli in ogni ovaia devono essere tenute insieme dalla guaina fibrosa (# nella parte ingrandita di figura 3C), che viene eliminato by presa in giro attenta (freccia spessa nella figura 3D, * indica un ovario mal presi in giro con ovarioli staccati) per esporre le ovarioli per la colorazione e la microscopia. Le ovaie rilasciati con steli oviductal strappati durante il rilascio del contenuto addominale possono anche essere utilizzati, purché non siano altrimenti danneggiati. Qualsiasi ovaie danneggiate (* nella Figura 3C) e altri contenuti addominali (punta di freccia in Figura 3C) devono essere eliminati. In diretta al microscopio delle ovaie Drosophila: Qui, dimostriamo la tecnica FLIP e il caricamento di coloranti strutturali e funzionali mitocondriali in ovaie di Drosophila. La tecnica FLIP, precedentemente applicato per valutare la continuità mitocondriale nelle cellule del follicolo Drosophila 9, è stato dimostrato qui nelle cellule ovariche di infermiere transgenici Drosophila </em&gt; che esprime il mitocondriale sonda di matrice mito-YFP sotto un promotore zucca costitutiva. Il protocollo FLIP coinvolge photobleaching iterativo e periodi di recupero intermittenti nella ROI FLIP consente una perdita di segnale nella ROI FLIP, nonché nelle regioni circostanti se sono in continuità con la ROI FLIP (Figura 4A). FLIP mirato ad una delle nuvole mitocondriali associati con le cellule infermiere porta ad una perdita superiore al 50% del segnale fluorescente dalla ROI blu e bianche che circondano la ROI FLIP rossa a 200 s (Figura 4B e C); il segnale del ROI verde è usato per la correzione del fondo. Il segnale fluorescente dalla ROI giallo nelle altre celle infermiere non mirati rimane costante durante questo intervallo di tempo, indicando imbianchimento complessiva minima durante il corso dell&#39;esperimento, (Figura 4B, e C). Inoltre, vedere video 1. Questo risultato indica che i mitocondriin infermiere cellule sono fusi loro membrane esterne ed interne, esemplificati nelle fasi 3 e 4 (figura 4A), mentre i mitocondri nei passaggi 1 e 2 non dovrebbero mostrare alcuna perdita di fluorescenza in questo lasso di tempo. È stato precedentemente dimostrato che una misura semi-quantitativa del potenziale mitocondriale per unità di massa mitocondriale può essere valutata mediante co-colorazione con il colorante potenziometrica TMRE e la macchia mitocondriale complessiva che riflette massa mitocondriale 13. Qui, la stessa tecnica è stata utilizzata per dimostrare la valutazione del potenziale mitocondriale per unità di massa nel tessuto ovarico Drosophila vivo. La microscopia confocale di vivo ovaie Drosophila colorati con TMRE dimostra una diminuzione del segnale con la profondità del tessuto (Figura 5A). Si prevede Questa perdita di segnale fluorescente a causa della crescente dispersione approfondire tessuto a verificarsi con qualsiasi tipo di fluoropHore con una data distanza di lavoro dell&#39;obiettivo in uso. Pertanto, è importante discernere la profondità massima del tessuto entro cui il fluoroforo può essere rilevato durante l&#39;imaging tessuto vivo. Ad esempio, vivere ovaie Drosophila colorati con la macchia mitocondriale complessiva (Mito) può essere ripreso utilizzando Impostazione del microscopio descritto (Tabella 1) in un intervallo di 20 micron dal vetrino, mentre la profondità massima stampabile decresce all&#39;aumentare dimensioni camera delle uova (Figura 5B). Le impostazioni microscopio ottimizzate per le macchie mitocondriali rilevano segnali positivi nei canali di rilevamento appropriati, mentre le impostazioni di esaminare qualsiasi indebita del segnale di cross-talk o fluoroforo cross-eccitazione da aspettarsi rilevato minimo o nessun segnale (figura 6A). Co-colorazione TMRE con la macchia mitocondriale complessivo può essere utilizzato sia qualitativa (Figura 6B) e quantitativa (Figura 6C e D &lt;/ strong&gt;) valutazioni del potenziale mitocondriale per unità di massa in tempo reale ovaie Drosophila. Ad esempio, a) una analisi qualitativa dimostra che la germarium Drosophila presenta maggiore potenziale mitocondriale per unità di massa in 2b fase in cui le cellule del follicolo somatiche sono sorti per incapsulare cellule germinali (teste di freccia in Figura 6B) e b) analisi semiquantitative dimostrano la differenza di potenziale mitocondriale per unità di massa tra AFC (estensibilità) e MBC, come analizzati da uno stadio 9 camera delle uova (figura 6C). Si noti che la quantificazione è stata eseguita da 2 diverse fette ottici per AFC e MBC, a seconda del loro piano di messa a fuoco. L&#39;utilizzo della sonda mito-ROS che è stato usato con successo in Drosophila 14 è dimostrato in strati vivi Drosophila ovarici epiteliali cellule follicolo, dove funzionali cloni nulli della proteina mitocondriale fissione Drp1were introdotte. La maggior parte, buNon t tutte, le GFP-negativi DRP1 cloni di cellule del follicolo nullo dal vivo esibire elevata colorazione di mito-ROS (Figura 7A e B). Si noti che anche se un segnale mitocondriale distinti non poteva essere rilevato in questo tessuto, la concentrazione della macchia mito-ROS potrebbe essere rilevato nella regione nucleare nei avanzata cellule follicolari post-mitotici, che sono significativamente più grandi delle cellule follicolari mitotiche (* in Figura 7C). Ciò può verificarsi a causa dell&#39;interazione del DNA nucleare e il prodotto di ossidazione fluorescenza del colorante mito-ROS, che è un derivato di etidio 15. Rilevamento di mitocondriale ciclina E nelle cellule del follicolo ovarico fisse di Drosophila: E &#39;stato recentemente dimostrato che i mitocondri in grado di regolare la molecola ciclo cellulare ciclina E reclutando alla superficie mitocondriale in cellule di mammifero e lo strato di cellule del follicolo Drosophila <sup&gt; 12. In particolare, la repressione della DRP1 esalta la ciclina E mitocondriale piscina in cellule di mammifero e lo strato di cellule di Drosophila follicolo 12. Qui, un esempio di localizzazione mitocondriale della ciclina E nelle cellule del follicolo di Drosophila è dimostrata utilizzando il protocollo di co-immunocolorazione descritto. Notare i livelli elevati di dCyclinE nelle DRP1 cloni nulli GFP-negativo in cui il segnale dCyclinE sovrappone con quella del segnale ATP-B mitocondriale nel germarium (Figura 8A), anche se il segnale non può essere risolto in elementi mitocondriali distinti con la risoluzione limitata di microscopia confocale. Inoltre, in MBC post-mitotici, le GFP-negativi DRP1 cloni nulli hanno entrambi i segnali dCyclinE nucleari e citosolici, con quest&#39;ultimo significativamente sovrapposizione con il segnale ATP-B, mentre le cellule GFP-positive tipo selvatico hanno solo un segnale dCyclinE nucleare (Figura 8B). Figura 1. Sviluppo delle Drosophila uovo Camere. Fumetto raffigurante un ovariole Drosophila costituito da una catena di sviluppo camere d&#39;uovo, ciascuno composto da un oocita e le cellule germinali (infermiere) incapsulati dallo strato di cellule del follicolo (somatica). Le camere di uova si sviluppano dal germarium e si sviluppano attraverso le fasi in cui le cellule del follicolo mitotiche diventano post-mitotico. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig2.jpg" /> Figura 2. piano sperimentale e preparazione. Strumenti (A) utilizzati nei metodi descritti: A. Fly fiala; B. insetti dissezione media; C. paraformaldeide; spazzola D. Fly; E. dissezione piatto; vetro F. copertina; tubo G. Microcentrifugare. piatto H. fondo di vetro; scivolo I. Vetro; J. 1000 microlitri micropipetta; K. 200 microlitri micropipetta; L. 2,5 microlitri micropipetta; M. Teasing ago con una punta piegata (punta è ingrandita); forcipe N. di spessore; forcipe O. sottili. (B) il flusso Un diagramma schematico che rappresenta i metodi descritti. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig3.jpg" /> Figura 3. La dissezione di Drosophila ovaie. (A) anestetizzati intero Drosophila. (B) Severed Drosophila addomi con o senza (*) il contenuto addominale. (C) Rilasciato Drosophila contenuto addominale, tra cui le ovaie (frecce e *) e altri contenuti(punte di freccia); ingrandimento della regione scatola a destra evidenziando anteriore (formica) e posteriore (Post) estremità della coppia di ovaie ricoperti dal gambo tubarico, dove i ovarioli sono tenuti dalla guaina fibrosa (#). (D) Teased Drosophila dell&#39;ovaio (marcatura freccia spessore opportunamente presi in giro e * marcatura mal presi in giro) rispetto a unteased dell&#39;ovaio (freccia sottile). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig4.jpg" /> Figura 4. Live-tessuto FLIP Assay. (A) Schema che rappresenta le fasi di mitocondriale fissione / fusione, che può essere valutata mediante un test di continuità mitocondriale appropriato utilizzando il metodo FLIP; in questo caso, una sonda mito-YFP nella matrice mitocondriale consente la assessmento di mitocondriale continuità della matrice. (B) Time-lapse ex vivo microscopia di un live transgenici Drosophila camera di uovo che esprime mito-YFP; solo punti di tempo selezionare (t) sono mostrati. Vedere Video 1 per tutti i punti di tempo. (C) Quantificazione del segnale fluorescente dal rispettivo ROI colorato in (B) sono espressi dopo la correzione di sfondo e la normalizzazione. Le frecce indicano i punti di tempo photobleaching reiterativi, mentre l&#39;intervallo di tempo tra due eventi di sbiancamento consecutivi è il tempo di recupero. barra della scala: 10 micron. Le immagini sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig5.jpg" /> Figura 5. diretta mitocondril La colorazione e Microscopia della Drosophila Ovariole. (A) singole sezioni ottiche di un live ovariole Drosophila macchiato di TMRE; l&#39;immagine è stata acquisita con i parametri descritti nella tabella 1. Z indica la distanza dal vetrino in micron. (B) Un live Drosophila ovariole caricato con la macchia mitocondriale complessiva (Mito). L&#39;immagine XZ della linea rossa immagine XY in è visualizzato, dove B è la parte inferiore e T è la parte superiore dell&#39;immagine acquisita. La distanza dal fondo alla linea blu è 20 micron. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig6.jpg" /> FIGURA 6. Co-colorazione di vivere Drosophila ovarioli con TMRE e il mitocondriale complesso Stain. (A) fetta ottica singola di un live ovariole Drosophila co-macchiato con TMRE e la macchia mitocondriale complessiva (Mito); * Indica un manufatto sperimentale descritto nella sezione di discussione. (B) di proiezione massima intensità di 3 fette ottici consecutivi del germarium in (A); frecce indicano la regione dove la fluorescenza TMRE viene aumentata. (C) fetta ottica singola di post-mitotico camera di uovo co-macchiato con TMRE e la macchia mitocondriale generale. I pannelli superiore ed inferiore mostrano il piano di messa a fuoco per la AFC e MBC, rispettivamente. Plot (D) Box mostrando intensità della fluorescenza media di TMRE e la macchia mitocondriale complessiva quantificata dai singoli AFC e MBC nelle regioni in scatola in (C). I baffi del diagramma a riquadri indicano i valori massimi e minimi per ogni gruppo, escludendo i valori anomali. <strong&gt; (E) Box diagramma che mostra il rapporto tra il segnale fluorescente dal TMRE e la macchia mitocondriale complessiva in singole cellule da (D). I baffi del diagramma a riquadri indicano i valori massimi e minimi per ogni gruppo, escludendo i valori anomali. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig7.jpg" /> Figura 7. La colorazione a Live DRP1 Null Mosaico Drosophila ovarioli con il colorante Mito-ROS. (A) fetta ottica singola di ovarioli colorati con il colorante mito-ROS. (B) di proiezione massima intensità di 2 fette ottici consecutivi di una camera di uovo individuo con cellule del follicolo del Mitofase tic macchiato con il colorante mito-ROS. (C) fetta ottica singola di una camera di uovo individuo con cellule del follicolo nella fase post-mitotico macchiato con il colorante mito-ROS; * Indica un segnale nucleare. La mancanza di UbiGFP segna cloni nulli DRP1. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig8.jpg" /> Figura 8. Co-immunocolorazione di fisso DRP1 Null Mosaico Drosophila ovarioli con dCyclinE e anticorpi ATP-B. (A) proiezione di massima intensità di 3 fette ottici consecutivi di germarium co-immunostained. (B) di proiezione massima intensità di 3 fette ottici consecutivi di co-Immunosnuto MBC post-mitotico. I contorni delimitare le UbiGFP-negativi DRP1 cloni nulli. barra della scala: 10 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/54989/54989fig9.jpg" /> Figura 9. Esempi di eventuali danni e artefatti. (A) Germarium di UbiGFP esprimono ovariole fissate e colorate con il colorante Hoechst DNA che mostra le lacune non dovuti (*). (B) camera di uovo di UbiGFP esprimono ovariole fissate e colorate con il colorante DNA Hoechst mostrando nick / lacrime (*). (C) Live ovariole con DRP1 cloni nulli UbiGFP-negativi colorati con il colorante mito-ROS che mostra una camera deformata (*) e una camera di uova danneggiata, permettendo parziali<html> colorazione della linea germinale (**); # Denota un vero e proprio forse macchia di una camera di uovo intatto nella stessa ovariole. (D) Live ovariole macchiato con il mito-ROS colorante che mostra una camera danneggiato generale con intensa colorazione artefatta della linea germinale. * Indica i danni indotti appiattito ovarioli con una perdita di segnale UbiGFP, dando così origine a cloni GFP-negativo artefatti. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/54989fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54989/54989vid1.jpg" /> Video 1. Live-tessuto FLIP Assay. L&#39;andamento temporale completa del dosaggio FLIP photobleaching a base descritta nella figura 5..com / files / ftp_upload / 54989 / Video1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere questo video. (tasto destro del mouse per scaricare). Tabella 1: Impostazioni microscopio confocale per l&#39;acquisizione delle immagini rappresentative presentate. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54989/Table1-Final.docx" target="_blank">Clicca qui per vedere Tabella 1. (tasto destro del mouse scaricare.)</a>

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Studio della struttura e della funzione mitocondriale nelle ovaie della Drosophila | Biologia | Video

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaie

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

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23.9K Views.  University of Alabama at Birmingham. Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper. 

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

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Genetica

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l&#39;analisi metabolica in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Biologia dello sviluppo

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochimica

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Biologia

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Analisi della fisiologia mitocondriale e della bioenergetica nei moscerini della frutta

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy metabolism with impairment of mitochondrial functions. Mitochondria are organelles that control both energy metabolism and cellular processes involved in cell survival and death. For this reason, approaches to evaluate mitochondrial function can offer important insights into cellular conditions in pathological and physiological processes. In this regard, high-resolution respirometry (HRR) protocols allow evaluation of the whole mitochondrial respiratory chain function or the activity of specific mitochondrial complexes. Furthermore, studying mitochondrial physiology and bioenergetics requires genetically and experimentally tractable models such as Drosophila melanogaster.
This model presents several advantages, such as its similarity to human physiology, its rapid life cycle, easy maintenance, cost-effectiveness, high throughput capabilities, and a minimized number of ethical concerns. These attributes collectively establish it as an invaluable tool for dissecting complex cellular processes. The present work explains how to analyze mitochondrial function using the Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. The pink1 gene is responsible for encoding PTEN-induced putative kinase 1, through a process recognized as mitophagy, which is crucial for the removal of dysfunctional mitochondria from the mitochondrial network. Mutations in this gene have been associated with an autosomal recessive early-onset familial form of PD. This model can be used to study mitochondrial dysfunction involved in the pathophysiology of PD.

Autore in primo piano: Esplorazione della funzione mitocondriale e della tossicità chimica con Drosophila melanogaster 

Here we present a high-resolution respirometry protocol to analyze bioenergetics in PINK1B9-null mutant fruit flies. The method uses the Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) protocol.

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in

Riepilogo

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Capitoli in questo video

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l'analisi metabolica in

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1^B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1^B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1^B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione