Name: imaging serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the clarity/cubic technique
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique at JoVE.com

This work was supported by the Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), an NHMRC project grant (#1086643). Prof. George Paxinos is supported by a Senior Principal Research Fellow NHMRC grant (#1043626).

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) an der University of New South Wales (die zugelassene ACEC Nummer 14 / 94A). 1. Herstellung des Transparent-Maus Spinal Cord <ol><li> Herstellung von Ice Cold Hydrogellösung <ol><li> Herstellung von 16% Paraformaldehyd-Lösung (PFA) <ol><li> In 16 g Paraformaldehydpulver in 70 ml vorgewärmten destilliertem Wasser (50-55 ° C) und unter Rühren auf einem beheizten Magnetrührer bis Paraformaldehyd gelöst ist. Hinweis: Nicht in die Lösung über 55 ° C zu erwärmen und sich bewusst sein, dass Paraformaldehyd toxisch ist. </li><li> Übertragen Sie die Paraformaldehydlösung zu einem Zylinder und mit destilliertem Wasser auf 100 ml. Kühlen Sie die Paraformaldehydlösung eine 4 ° C Kühlschrank mit. </li></ol></li><li> Man löst 125 mg VA-044-Initiator in 26,25 ml destilliertem Wasser und kühlt die Lösung in einem 4° C Kühlschrank. </li><li> Cool 5 ml Acrylamidlösung (40%), 1,25 ml Bis-Lösung (2%) (ACHTUNG: Bis und Acrylamid-Lösungen sind giftig, können genetische Defekte oder Krebs verursachen), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% PFA-Lösung und die VA-044 Initiatorlösung auf Eis. </li><li> Mischen Sie die oben genannten Lösungen auf Eis. Bemerkung: das Gesamtvolumen 50 ml beträgt. </li></ol></li><li> Perfusions und Sammlung der Maus Spinal Cord <ol><li> Anästhesieren eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80 mg / kg) und xyzaline (5 mg / kg) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Die Dosierung für die Maus kann für Ratten als niedriger sein. </li><li> Auf einem geeigneten Kunststoffoberfläche in einer Abzugshaube, befestigen Sie die Schenkel der Maus vom Körper weg (Klebeband ist wirksam), sobald die Maus auf eine Prise seiner Haut des Fußes reagiert nicht. </li><li> Schneiden Sie die Maus Haut über der Brust und dann die Knochen Brust das Herz mit einer Schere zu belichten. </li><li> Mit Hilfe einer Schlauchpumpe mit einer 25 G Nadel befestigt Atee Ende des Schlauchs, legen Sie die Nadel in den linken Ventrikel des Herzens, schnippeln in den rechten Vorhof ein Ausgangspunkt für das Blut zu schaffen und dann mit 40 ml 0,9% physiologischer Kochsalzlösung mit einer Rate von etwa 10 ml / min beginnen Waschen. </li><li> Wenn Sie fertig sind, perfuse die Maus mit 35 ml eiskaltem Hydrogel-Lösung. Anmerkung: mit einer Geschwindigkeit von 10 ml perfundieren / min Quellung des Nervengewebes zu vermeiden. </li><li> Inzision in die Haut über den Rücken mit einem Messer und dann die Muskeln entfernen neben dem wirbel. der Wirbelbögen, auf der einen Seite nach dem Schneiden und sie auf die andere Seite, nehmen Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule mit einer feinen Schere Spiegeln. </li></ol></li><li> Löschen der Maus Spinal Cord <ol><li> Legen Sie das Rückenmark in 15 ml Hydrogel-Lösung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie 10 ml des Hydrogels Lösung und gießen Sie den Rest der Lösung mit den Rückenmarksegmente zu einem 5-ml-Tube. Füllen Sie das 5-ml-Röhrchen mit dem Hydrogel-Lösung, bis er vollständig gefüllt ist. </li><li> Strecken Sie ein kleines Stück Parafilm über den oberen Teil der 5-ml-Tube und dann wickeln Parafilm um den Hals des Rohres. Hinweis: Achten Sie darauf, die Kontakte Parafilm das Hydrogel-Lösung und es gibt keine Blasen zwischen dem Hydrogel-Lösung und der Parafilm. </li><li> Setzen Sie die 5-ml-Röhrchen in einem 37 &#160; Ofen über Nacht ° C. Beachten Sie die Hydrogel-Lösung, bis es ein Gel wird. </li><li> Nehmen Sie die 5-ml-Röhrchen aus dem Ofen heraus und entfernen Sie das Gel aus der Tube mit einem Schraubenschlüssel (wie ein geschaufelt 1 ml Pipettenspitze). Entfernen Sie das Gel aus dem Rückenmarksgewebe durch das grobe Gewebe auf das Gel kleben und dann die groben Gewebe entfernt (das Gel mit dem Gewebe haften und wird daher von dem Gewebe entfernt werden). </li><li> das Gel aus dem Rückenmarksgewebe, waschen das Rückenmark 4-mal mit 1x PBS (pH 7,4) für 24 Stunden auf einem Schüttler Nach dem Entfernen. </li><li> Bereiten Sie die CUBIC Clearing-Lösung durch Auflösen von 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml destilliertem Wasser. Hinweis: Ein heißer Rührer verwendet wird. Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und kühlt auf Raumtemperatur. Hinweis: 10 g dieser drei Chemikalien sind für eine Maus. </li><li> Schneiden Sie das Rückenmark der Maus koronalen in 2-3 mm lange Segmente mit einer Rasierklinge und steckte sie in 5 ml der obigen CUBIC Clearing-Lösung. Platzieren auf einem Schüttler in dem Ofen bei 37 &#160; ° C für 3 Tage. </li><li> Drei Tage später, ändern Sie die Clearing-Lösung auf ein frisches. Anmerkung: Die obige Lösung wird vor der Verwendung hergestellt. </li><li> Zwei bis drei Tage später nach der CUBIC Clearing-Lösung erfrischend, überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes gegen ein Papier mit Schrift 8 Buchstaben. Wenn es transparent ist, können die Buchstaben durch die gelöscht Gewebe zu sehen. Entfernen Sie die Clearing-Lösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) das Gewebe 4-mal pro Tag (alle 6 Stunden) zu waschen. </li></ol></li></ol><ol><li> Inkubieren der Rückenmarksegmente in der primären Antikörperlösung (anti-Serotonin, in rabbit angehoben, verdünnt 1: 100 in PBST) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Antikörperlösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100), um die Rückenmarksegmente 4 mal pro Tag (alle 6 Stunden) in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen. </li><li> Entfernen Sie die PBST-Lösung und fügen Sie den sekundären Antikörper-Lösung (594 konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, 1: 100 verdünnt in PBST), um das Gewebe für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C Ofen inkubiert. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und 4 ml PBST Rückenmark Segmente 4-mal täglich zu waschen (alle 6 Stunden) auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C. Am nächsten Tag ist das Gewebe für die Bildgebung bereit. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Entfernen Sie die PBST-Lösung und 4 ml 85% Glycerin auch den Brechungsindex des Gewebes zu machen. </li><li&gt; Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald klar in etwa 1 Stunde, legte das Gewebe, auf einem großen, dünnen Glasträger, die den Halterahmen des Multi Foto Fluoreszenzmikroskop passt. </li><li> Ein paar Tropfen von 85% Glycerin neben dem Rückenmarksgewebe und das Deckglas mit einem 22 x 50 mm 2 Deckglas. Hinweis: Die Ausrichtung des Rückenmarks entscheidet, wie das Bild aussieht. </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger auf den Halterahmen des Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskop und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen. </li><li> Wählen Sie den Helium-Neon-Laser-Linie 594 nm und stellen Sie die Intensität des Lasers auf das optimale Niveau, indem die Helligkeit des positiven Signals im Livebild zu überprüfen. </li><li> Wählen Sie den Scanbereich des Rückenmarksgewebe das 20x-Objektiv mit (in Wasser, NA 0,7) und bereiten Sie einen Z-Stapel zu schaffen, und die Tiefe jeder Schritt auf 3 &amp; mgr; m. </li><li> Scannen Sie das Gewebe von oben nach unten in der z-Stapel unter dem 20X objective und 63X Ziel dann (in Öl, NA 1,4) (Schrittweite betrug 1 &amp; mgr; m) sind. Rekonstruieren von 3D - Videos mit einer 3D - Software - 28. </li></ol>

<ol>
	<li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs:+partial+involvement+of+serotonergic+pathways.">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li><li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse.">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li><li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn.">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li><li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation,+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection.">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li><li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat's+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus.">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li><li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X.">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li><li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord:+an+anterograde+immunohistochemical+study.">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li><li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord:+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study.">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li><li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons.">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li><li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord.">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li><li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum:+evidence+for+connectional+heterogeneity.">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li><li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique.">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li><li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats:+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels.">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Ert&#252;rk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li><li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy.">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY:+senile+plaques,+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D.">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li><li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OsiriX:+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images.">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das Protokoll beschrieben zeigt, wie auf Bild serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus mit dem kombinierten CLARITY und CUBIC Techniken. Es wird ein schneller Clearing - Prozess im Vergleich zum passiven Clearing - Protokoll von Cheung et al. Entwickelte 14 und Tomer et al. 15 und ermöglicht es dem Rückenmarksgewebe gut durch das Hydrogel während Clearing unterstützt werden. Ein wichtiger Schritt bei der Fixierung der Rückenmark der Maus, wie von Cheung et al. 14 und Tomer et al. 15, ist um die Lösungen auf Eis kühl zu halten, die die Polymerisation der Chemikalien verhindert. Der andere kritische Schritt ist die Maus langsam mit der Hydrogel-Lösung zu perfundieren Quellung des Nervengewebes zu vermeiden. Für das Hydrogel-Lösung ein Gel zu werden, wird die Entgasung erforderlich. Als Alternative dazu haben wir Parafilm die Oberseite des Rohrs zu bedecken und links keine Luftblasen zwischen dem hydrogel Lösung und die Parafilm. Das funktionierte sehr gut und das Hydrogel-Lösung wurde zu einem Gel nach ein paar Stunden. Obwohl einige Blasen in dem Gel gefunden wurden, haben sie mit den folgenden Experimenten nicht stören, die durch das Fehlen von Blasen in dem Rückenmarksgewebe nachgewiesen. Clearing ist der kritischste Schritt und erfordert eine Kombination von Reagenzien. Die Klärlösung, Aminoalkohol enthält, entfernt das Lipid der Rückenmarksgewebe viel schneller als die SDS / Borsäure basierend Klärlösung im ursprünglichen Klarheit Protokoll 16. Der Vorteil der Klarheit und kubischem gegenüber herkömmlichen immunhistochemischen Techniken ist, dass die gesamte Gewebeblock ohne Schneiden in das Gewebe abgebildet werden kann, als Ergebnis, die Kontinuität der serotonergen Fasern beibehalten wird, und es ist möglich, die gleiche Faser für eine lange Strecke zu folgen, innerhalb des Z-Stapel. Mit diesem Vorteil kann die Besicherung sicher mit den 3D-Bildern identifiziert werden, einnd Roman Schlussfolgerungen können daher über die Natur der serotonergen Bahnen hergestellt werden. Das Protokoll beschrieben ist ein praktisches Werkzeug für die Untersuchung von Fasersystemen sowie Kerne durch einfaches Markieren des Gewebes mit spezifischen Antikörpern. Diese Technik ist auch eine ideale Wahl für verschiedene Systeme im gleichen Gehirn der Maus Abfrage durch doppelte oder dreifache Kennzeichnung verwendet wird. In unserem Labor Einstellung eine Multi-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskop war mit einem Arbeitsabstand von etwa 300 &amp; mgr; m zur Verfügung. Dies begrenzt unser Bild auf ein Maximum von 600 &amp; mgr; m, wenn beide Seiten des Gewebes abgetastet werden. Jedoch kann ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop, können Bild die gesamte Maus Gehirn und Rückenmark durch ihre volle Breite, Länge und Tiefe. Der andere Vorteil dieser Technik ist, dass die Antikörper eluiert werden können und dann noch verschiedene Antikörper oder Antikörper angewendet wieder auf dasselbe Gewebe. Dies reduziert Tierversuchen erheblich sowie die mit der Vorbereitung von neuen Hirngewebe verbundenen Kostenfür jedes Experiment. Aus dem gleichen Grund kann diese Technik auf andere Gewebe angewendet werden. Es wurden bereits Untersuchungen über die Lunge, Niere durchgeführt wurden, Herz, Darm und Tumorgewebe 26,27. Es gibt auch Beschränkungen dieser Technik beispielsweise enthält der Raphe-Kerne in der Maus hindbrain viele Typen von Neuronen, einschließlich GABAerge Neuronen. Obwohl CLARITY und CUBIC wird für die Untersuchung der Verteilung der verschiedenen Arten von raphespinal Fasern in einem einzigen Maus Gehirn und Rückenmark zu ermöglichen. Diese Neuronen, die nicht speziell identifiziert werden durch ihre Neurotransmitter oder Proteinmarker kann nicht in dieser Einstellung identifiziert werden. Eine Alternative ist die spezifische Neuronen oder Fasersysteme mit Nukleinsäuresonden , wie in in - situ - Hybridisierung zu etikettieren. Dies ist, andererseits durch die Kennzeichnungssystem und den zur Verfügung stehenden Filter für Fluoreszenz-Bildgebung beschränkt. Imaging alle raphespinal Fasern bleibt daher eine Herausforderung.Wenn diese Techniken mit einer intrakranialen Injektion eines anterograde Tracer (wie Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L) wurden vereinigt, könnte es möglich sein serotonergen Fasern, GABAergen Fasern zu sehen, und andere.

Supraspinal projections are responsible for the modulation of diverse behaviors such as pain perception. One of the projections carrying nociceptive information contains serotoninergic fibers, which originate from the hindbrain raphe and adjacent reticular nuclei1,2. Physiological and pharmacological studies have demonstrated an increased release of serotonin in the dorsal horn of the spinal cord after electrical stimulation of the raphe nuclei in the hindbrain3-5. In the rat and opossum, serotonergic raphespinal fibers have dense terminals, not only in the dorsal horn6-8, but also in the intermediate zone7,9,10, the ventral horn7,11, and even lamina 1012,13. There are no similar studies in the mouse. The present study aimed to map the termination pattern of serotonergic fibers arising from the hindbrain raphe nuclei and their adjacent reticular nuclei in the mouse spinal cord using the recently published CLARITY14 method and its modification - CUBIC15. 
Conventional fluorescence or peroxidase immunohistochemistry of the spinal cord clearly shows the distribution of serotonergic fibers in the gray matter of the spinal cord in 30-40 &#181;m thick cross-sections. However, this approach does not show the continuity of the serotonergic fiber tracts in the white matter and their collaterals in the gray matter. Although the 3D reconstruction of histological sections has advanced our knowledge of fiber tracts, it remains a challenge for histologists and anatomists to follow a single tract due to small distortions in the tissue caused by cutting. To circumvent this obstacle a number of researchers have developed various protocols for making the whole tissue structure transparent, and collecting an image of unaltered tissue in a single video file17-21. So far, the clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/ immunostaining compatible, tissue hydrogel (CLARITY) technique, developed by Deisseroth's group14,15, as well as CUBIC, developed by Susaki et al16 are the most successful. Since the publication of the protocols, many researchers have started using these techniques to investigate various aspects of biological tissues, including, not only the brain22-25, but also the heart, kidneys, intestine, and the lungs26,27. 
By fixing the mouse spinal cord with the hydrogel solution (CLARITY) and clearing with the CUBIC reagents (which is a much faster method than that described by the original CLARITY protocol14,15), a spinal cord tissue block of 2-3 mm long was cleared within two weeks and immunofluorescence staining for serotonin completed in eight days. With just a combination of chemical agents, conventional immunohistochemistry can be used to create an image of individual fiber tracts in a 3D video file in approximately one month.

<table><tbody><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40% acrylamide solution</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-&lt;br/&gt;879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&amp;amp;region=AU</td></tr><tr><td>urea</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N&#039;,N&#039;-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&amp;reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&amp;amp;region=AU</td></tr><tr><td>serotonin antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&amp;reg; 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>multi-photon microscope</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

imaging serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the clarity/cubic technique

Langabsteigenden Fasern auf das Rückenmark sind für die Fortbewegung, die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen. Die Faserabschlußmuster im Rückenmark der Mehrheit dieser Fasersysteme wurden nicht gründlich in einer beliebigen Spezies untersucht. Serotonergen Fasern, die an das Rückenmark projizieren, wurden in Ratten und opossums auf histologischen Schnitten und ihre funktionelle Bedeutung abgeleitet wurde im Rückenmark auf ihre Faserabschlußmuster untersucht basiert. Mit der Entwicklung der Klarheit und kubischem Techniken ist es möglich, dieses Fasersystem und seiner Verteilung in das Rückenmark zu untersuchen, die bisher unbekannte Eigenschaften von serotonergen supraspinal Wege aufzuzeigen wahrscheinlich ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus die kombinierte CLARITY und CUBIC Techniken. Das Verfahren beinhaltet die Perfusion einer Maus mit einem Hydrogel-Lösung und Klärung des Gewebes mit einer combination Reagenzien zu löschen. Rückenmarksgewebe wurde in knapp zwei Wochen und die anschließende Immunfluoreszenzanfärbung gegen Serotonin gelöscht wurde in weniger als zehn Tagen abgeschlossen. Mit einem Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskop wurde das Gewebe abgetastet und ein 3D-Bild rekonstruiert wurde Osirix Software.

Dieser Abschnitt zeigt die Ergebnisse von Serotonin-Antikörper-Färbung in der transparenten Rückenmark der Maus eine Kombination aus der CLARITY und CUBIC-Protokolle. Wir zeigen , dass serotonerge Fasern in allen Schichten des Rückenmarks vorhanden sind , mit einer Vorherrschaft im ventralen Teil des ventralen Horn (Abbildung 1, siehe auch Video 1). Das Kontrollgewebe hatte keine positive Fasern (Ergebnis nicht gezeigt). Im ventralen Horn, dicht gepackte serotonergen Fasern im ventromedialen Teil des Vorderhorn vorhanden sind , und sie erstrecken sich in Richtung des seitlichen Teils des Vorderhorn (2, siehe auch Video 2). Einige immunopositive Fasern erstrecken sich auch von der ventralen Horn in Richtung des Hinterhorn oder den zentralen Kanal. Immunopositiv Fasern sind in allen Schichten des dorsal horn aber es gibt eine kleine Lücke zwischen positiven Fasern in Lamina 2 und 4, insbesondere in lateralerTeil des Hinterhorns. Die Mehrzahl der serotonergen Fasern im dorsalen Horn sind von kleinem Durchmesser und nur eine geringe Anzahl von ihnen sind von großem Durchmesser (Video 1). In einem Horizontalschnitt, dicht gepackten serotonergen Fasern in der ventralen Horn wurden entlang der Längsachse des Rückenmarks und bilden eine große Faserbündel zu reisen beobachtet. Die interessanteste Ergebnis ist, dass diese große Faserbündel ausgibt Zweige regelmäßig entlang der Längsachse, die auf das Faserbündel senkrecht sind. Diese Zweige weiter entlang ihrer Bahn zu den seitlichen Teil des Ventralhorn besichern. Verglichen mit diesen Zweigen, sind die , die in Richtung der Mittellinie erstreckende unregelmäßig und geringer (Abbildung 2). Unter dem 63X Ziel wurden die serotonerge Fasern in den dorsalen Horn an verschiedenen Punkten entlang der Bahn des Trakts entlang der Achse des Rückenmarks und enden zu reisen beobachtet. Die dicken Fasern sind unter der dünnen f sporadisch verteilt<html> Ibers (Abbildung 3, siehe auch Video 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53673/53673fig1.jpg" /> Abb . 1: Serotonerge Fasern in einem koronalen Abschnitt der Lendenwirbel bei 200 - facher Vergrößerung links ist das Vorderhorn, rechts ist das Hinterhorn, dorsalen medialen Teil des Rückenmarks ist, und ventralen ist der seitliche Teil des Rückenmarks. Der Maßstab beträgt 100 &amp; mgr; m. Serotonergen Fasern sind in allen Schichten, insbesondere im ventromedialen Teil des ventralen Horn, wo die Faserdichte hoch ist. Diese Fasern erstrecken sich in Richtung sowohl der lateralen Teil des Vorderhorn und dem zentralen Kanal oder Hinterhorn. Die Dichte der Fasern in anderen Schichten ist gering. Die Mehrheit der serotonergen Fasern sind dünn. Nur eine kleine Anzahl von Fasern sind dick, und sie sind sowohl in der dorsalen Horn und der ventralen Horn gesehen (&gt; siehe Video 1 (Rechtsklick zum Download) auch). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53673/53673fig2.jpg" /> Fig . 2: Serotonerge Fasern im ventralen Teil des ventralen Horns bei 200facher Vergrößerung links und rechts sind die seitlichen Seiten des Rückenmarks, dorsal ist die rostral Teil des Rückenmarks und ventral ist der kaudalen Teil des Rückenmarks. Der Maßstab beträgt 100 &amp; mgr; m. Serotonergen Fasern gezeigt entlang der Längsachse des Rückenmarks zu reisen und in dem mittleren Abschnitt des ventralen Horn gepackt, wo sie eine dicke Faserbündel bilden. Aus diesem Bündel sind einige Zweige in regelmäßigen Abständen in Richtung der seitlichen Teil des ventralen Horn erweitert, während andere, die in Richtung der Mittellinie erstrecken sind unregelmäßig und kürzer. Diese Fasern an vielen Punkten entlang des Pfads des Traktes beenden ( <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53673/Video2.mp4">siehe auch Video 2</a>(Rechtsklick zum Herunterladen)). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53673/53673fig3.jpg" /> Abbildung 3: Serotonerge Fasern im dorsalen Horn unter bei 630X Vergrßerung Links ist das Seitenteil des Rückenmarks, richtig die mediale Teil des Rückenmarks ist, dorsalen und ventralen zur dorsalen beziehen und ventralen Teil des dorsal horn, respectively. . Der Maßstab ist 7 um. Serotonergen Fasern entlang der Längsachse des Rückenmarks auf Reisen sind und entlang dem Weg des Traktes beenden. Diese Fasern sind hauptsächlich mit kleinem Durchmesser mit einer kleinen Anzahl von dicken Fasern verwirbelt. Diese Fasern selten einander überlappen ( <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53673/Video3.mp4">siehe auch Video 3 (Rechtsklick zum Herunterladen)</a> ).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique at JoVE.com

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.4K Aufrufe.  Neuroscience Research Australia. Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Serie: Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, thereby improving the reproducibility of the experiments.
These methods need two requirements to be fulfilled: clarity of the surgical anatomical pathway and simplicity and convenience of the laboratory device. Crucially for the operator, a clear anatomical pathway provides minimally invasive exposure, which avoids additional damage to the experimental animal during the surgical procedures and allows the animal to maintain a consistent and stable anatomical morphology during the experiment.
In this study, the use of a novel integrated platform called the SCI coaxial platform for spinal cord injury in small animals to expose the T9 level spinal cord in a minimally invasive way and stabilize and immobilize the vertebra of mice using a vertebral stabilizer is researched, and, finally, a coaxial gravity impactor is used to contuse the spinal cord of mice to approach different degrees of T9 spinal cord injury. Finally, histological results are provided as a reference for the readers.

Minimally invasive techniques and a simple laboratory device improve the reproducibility of the spinal cord injury model by reducing operative damage to the experimental animals and allowing anatomical morphology maintenance. The method is worthwhile because the reliable results and reproducible procedure facilitate investigations of the mechanisms of disease reparation.

Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, ...

Establishment of Central Cord Syndrome Model in C57BL/6J Mouse

Animal models of central cord syndrome (CCS) could substantially benefit preclinical research. Identifiable anatomical pathways can give minimally invasive exposure approaches and reduce extra injury to experimental animals during operation, enabling the maintenance of consistent and stable anatomical morphology during experiments to minimize behavioral and histological differences between individuals to improve the reproducibility of experiments. In this study, the C6 level spinal cord was exposed using a spinal cord injury coaxial platform (SCICP) and combination with a minimally invasive technique. With the assistance of a vertebral stabilizator, we fixed the vertebrae and compressed the spinal cords of C57BL/6J mice with 5 g/mm2 and 10 g/mm2 weights with SCICP to induce different degrees of C6 spinal cord injury. In line with the previous description of CCS, the results reveal that the lesion in this model is concentrated in the gray matter around the central cord, enabling further research into CCS. Finally, histological results are provided as a reference for the readers.

The present protocol simulating central cord syndrome (CCS) in mice has improved repeatability and minimized operation damage to the experimental animals, avoiding disrupting the anatomical structure excessively. The strategy in this study is advantageous because it allows for research into injury mechanisms by producing consistent results.

Etablierung des Modells des Zentralschnursyndroms in der C57BL/6J-Maus

Animal models of central cord syndrome (CCS) could substantially benefit preclinical research. Identifiable anatomical pathways can give minimally ...

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...