Name: optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH / NINDS) Zuschuss 1R01NS086981 und der Conrad N. Hilton Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Laurent Bentolila und Dr. Matthew Schibler für ihre unschätzbare Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken, die an der CLARITY-Forum beigetragen haben (http://forum.claritytechniques.org). Wir danken vor allem Dr. Karl Deisseroth für eröffnet sein Labor diese faszinierende Technik zu lehren. Die Autoren sind dankbar für die großzügige Unterstützung von der Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace-Stiftung, Ahmanson Stiftung, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. und Linda R. Dietel Philanthropische Fund, und Northstar Fund . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde, auch teilweise von der National Center for Research Resources und vom Amt des Direktors der Nation unterstütztal Institutes of Health unter preis Zahlen C06RR012169, C06RR015431 und S10OD011939. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt. THY1-YFP, PLP-EGFP und PV-tdTomato Mäuse wurden für diese Experimente verwendet, aber alle Mäuse fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfolgreich gelöscht werden kann und abgebildet. 1. Gewebepräparation Achtung: Paraformaldehyd (PFA) und Acrylamid sind giftig und Reizstoffe. Führen Sie Experimente diese Reagenzien in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). <ol><li> Sacrifice das Tier in Euthanasie Kammer mit ~ 1 ml Isofluran, bis die Atmung aufhört (~ 2 - 3 min). </li><li> Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe auf ~ 5 ml / min bis intrakardial perfuse die Maus mit Perfusionslösung (Tabelle 1) bei 4 ° C , bis das Blut aus den Geweben gelöscht (5 - 10 min). </li><li> Ändern Sie den Perfusat zu Fixierungslösung (Tabelle 1)bei 4 ° C bis zur Ausschöpfung der Hals und Schwanz deutlich versteift (5 - 10 min). </li><li> Beenden Sie die Perfusion und köpfen das Tier. Sezieren vorsichtig heraus das Gehirn aus dem Schädel , indem zuerst das Bindegewebe Entfernen des Schädels umgibt und dann Knochen von der ventralen Oberfläche des Schädels zu entfernen und das Gehirn heraus (Abbildung 1a) anheben, wie in 20 beschrieben. Hinweis: Geben Sie die Entfernung von Knochen besondere Sorgfalt flocculonodularis Lappen des Kleinhirns umgibt und die Riechkolben. <ol><li> Präparieren Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule durch sanft mit der Spitze eines feinen, scharfen Schere zwischen dem Rückenmark und der Wirbelsäule einsetzen und die einzelnen Wirbelsäulensegmenten weg schneiden, wie in 21 beschrieben. </li></ol></li><li> Hemisect das Gehirn, indem es in einer Kunststoffmatrix Mausgehirn Plazieren und mit einer Matrix Klinge entlang der Mittellinie schneiden. </li><li> Fügen Sie jede Hemisphäre und Rückenmark zu trennen 50 ml Zentrifugen Wannees mit ~ 40 ml Hydrogel - Lösung (Tabelle 1). Von diesem Punkt an Abdeckung die Rohre mit einer Aluminiumfolie, die Fluorophore bei allen nachfolgenden Schritten zu schützen. </li><li> Inkubiere das Rohr die Probe in Hydrogel bei 4 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm) für 7 Tage enthält. </li></ol> 2. Polymerisation <ol><li> Verwerfen ~ 25 ml Hydrogel, Konservieren der Probe und ~ 25 ml Hydrogel in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Desoxygenieren die Probe durch Entfernen der Kappe und das Zentrifugenröhrchen in Exsikkator Glas platzieren und das Glas auf ein Vakuum zu verbinden. Gelten das Vakuum für mindestens 10 min gelösten Gasen zu ermöglichen, aus der Lösung und Blasen bilden zu kommen. Schütteln Sie die Luftblasen zu entfernen. </li><li> Ersetzen Sie das Vakuum im Exsikkator Glas mit 100% Stickstoffgas über 2 - 3 min. Sobald der Druck ausgleicht (einmal die Spitze des Exsikkator Glas geöffnet werden kann), die Kappe schnell das Rohr die Wiedereinführung von Sauerstoff zu verhindern. </li><li> Polymerize das Hydrogel durch das Rohr mit Probenabgabe in einem 37 ° C Wasserbad für 3 Stunden, bis die Polymerisation abgeschlossen ist. Polymerisierte Hydrogel nimmt auf einer gelartigen Konsistenz (Abbildung 1b). Hinweis: Eine geringe Menge an nicht-polymerisierten Hydrogels am oberen akzeptabel ist. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um den polymerisierten Probe aus dem Zentrifugenröhrchen zu entfernen, dann schneiden Sie das überschüssige Hydrogel aus der Probe entfernt. </li><li> Entfernen Sie die verbleibenden Hydrogel, das durch die Probe auf einem fusselfreien platzieren frei wischen und sanftes Reiben und Rollen des Gewebes auf sie, nur hinter einer dünnen Schicht aus polymerisiertem Hydrogel auf die Probe zu verlassen. </li></ol> 3. Lipidentfernung Hinweis: Lipid-frei Gewebe zerbrechlich ist, mit Vorsicht handhaben. Verwenden Sie eine Zelle Sieb, wenn das Rohr Ablassen verlieren Probe zu vermeiden. Außerdem quellen die Probe während des gesamten Löschvorgang jedoch Quellung während der Brechungsindex-Anpassungsprozeß umgekehrt werden. Achtung: Sodium Dodecylsulfat (SDS) und Borsäure sind reizend. Führen Sie Experimente, um diese in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Schutzbrille) verwendet wird. <ol><li> Übertragen polymerisierten Probe in ein sauberes 50 - ml - Zentrifugenröhrchen eingewogen und 45 ml Clearing - Puffer (Tabelle 1). Inkubieren bei 45 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm). Ändern Sie den Puffer täglich für zunächst 7 Tage um die verbrauchte Clearing-Puffer in chemische Abfälle Abgießen und Zugabe von ~ 45 ml frischem Clearing-Puffer. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen. </li><li> Nach den ersten 7 Tagen Inkubation der Probe bei 40 ° C und Austausch Clearing Puffer alle 2 - 3 Tage. Weiter Lichtung , bis alle Lipide löslich gemacht sind und Gewebe erreicht Transparenz (Abbildung 1c). Dies wird 4 - 6 Wochen für eine Maus Gehirnhemisphäre und 2 - 4 Wochen für eine Rückenmark. </li><li> Sobald Gewebe gelöscht ist, übertragenProbe auf eine neue 50 ml - Zentrifugenröhrchen und wasche 4 Mal in PBST (Tabelle 1) bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 min) über 24 h Rest SDS zu entfernen. </li></ol> 4. Molekulare Färbung Achtung: 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) ist ein Reizmittel und alle Experimente unter Verwendung sollte es in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen Sie die Probe in einen sauberen 15 ml Zentrifugenröhrchen geben und mit 1 ug / ml DAPI in 1x PBST, pH-Wert 7,5. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 24 Std. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen. </li><li> 3 x waschen in PBST bei RT für mindestens 6 h / Wäsche. </li></ol> 5. Anpassung des Brechungsindex Achtung: 2,2&#39;-Thiodiethanols (TDE) ist ein Reizmittel und alle Experimente verwendet es shOuld in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen, um die Probe in einen sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen geben und mit 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Inkubieren bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 Upm) für 24 Std. </li><li> Austausch von 30% TDE mit 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. bei 40 ° C inkubieren unter leichtem Schütteln 24 Stunden. Hinweis: Die Probe wird schrumpfen zurück auf etwa Originalgröße. </li><li> Auf einem flachen, saubere Oberfläche ein Stück wiederverwendbarer Klebstoff in einen Zylinder mit einheitlichem Durchmesser rollen nur geringfügig größer als die Dicke der Probe. </li><li> Legen Sie den wieder verwendbaren Klebstoffzylinder in einem offenen Kreis (~ 25 mm Innendurchmesser mit einer kleinen Öffnung an der Spitze) auf einem 40 mm Glasbodenschale. Wenn Korrekturen vorgenommen werden müssen, entfernen Sie den Zylinder aus dem Glas und schnitt mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Sie Spitze eine p1000 Pipette eine Dichtung zwischen dem wieder verwendbaren Klebstoff und Glas zu schaffen, indemes um den äußeren Rand des Zylinders rollen. </li><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l 63% TDE auf die Glasschale und verteilen um die Glasoberfläche innerhalb des Kreises von wieder verwendbaren Klebstoff zu bedecken. </li><li> Mit einem Spatel, legen Sie sorgfältig die Probe in der Mitte des Kreises, kümmert sich nicht um Blasen zu bilden. </li><li> Pipettieren weitere 100 &amp; mgr; l von 63% TDE direkt auf die Probe, dann sofort legen Sie eine 40 mm Kreisdeckglas über den wieder verwendbaren Klebstoff. </li><li> Mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger beider Hände, drücken Sie vorsichtig um den Umfang des Kreises, bis das Deckglas Kontakt mit der Probe gemacht hat. </li><li> Langsam bringen die Glasbodenschale in eine aufrechte Position gegen eine Fläche ruht, dann fügen Sie 63% TDE mit einer Pipette, bis die Lösung die kleine Öffnung am oberen Ende erreicht. Mit einem fusselfreien wischen Sie die Pipettenspitze zu trocknen, so dass die Lösung nicht auf das Glas tropft. Zur Vermeidung von Blasen in der Kammer, leeren Sie nie die Pipette den ganzen Weg. </li><li> Nachdie kleine Öffnung, fügen Silikonelastomer den Kreis und schaffen eine geschlossene Kammer zu umschließen. Warten Sie 5 Minuten für sie vor der Abbildung, um zu trocknen. </li></ol> 6. Mikroskopie Achtung: Die Laser in der konfokalen, Ebene Beleuchtung und Lichtbogen-Mikroskopie verwendet werden, sind sehr leistungsfähig und kann zur Erblindung führen. Alle Experimente Laser verwendet wird, sollten nach einer umfangreichen Ausbildung und mit großer Vorsicht und entsprechenden Augenschutz durchgeführt werden. <ol><li> Setzen Sie die Druckkammer mit der Probe im Inneren auf der Bühne eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien). So schalten Sie die Argon Anregungslaser, klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration an der Spitze des Programms dann den Laser-Symbol. Markieren Sie das Kästchen neben Argon, den Laser einzuschalten und die Folie Skala bis 30% bewegen. Beachten Sie die Zeiger langsam erwärmen zu der gewählten Position. <ol><li> Zurück zur acquire Reiter an der Spitze. In dem großen Feld &quot;Beam Path Settings &amp;# 34; gehen Sie zum Laden / Speichern-Box Einstellung und das Dropdown-Menü wählen Sie einen entsprechenden Wellenlängenkanal Bild YFP (527 nm) zu wählen. </li></ol></li><li> Wählen Sie die entsprechende Ziele für die Bildgebung durch den roten Hyperlink Auffinden der Aufschrift &quot;Ziel: aktuelle Objekt&quot; unter dem Kanaleinstellungen Feld. Ein Klick auf die Registerkarte öffnet alle verfügbaren Ziele und eine Auswahl automatisch den Turm drehen. <ol><li> Verwendung Ziele (z. B. 10X) mit einem großen Arbeitsabstand (größer als die Dicke des Gewebes abgebildet, beispielsweise 11 mm ist) und eine große numerische Apertur (z. B. 0,3) in der Ebene der Bildauflösung zu maximieren und zu minimieren optische Schnittdicke. </li></ol></li><li> Auf der linken Spalte der Dropdown-Menüs, öffnen Sie die &quot;XY: Auflösung&quot; Fenster Erfassungsmatrix zu setzen, die so genannte &quot;Format&quot;, auf 1.024 x 1.024 oder ein angemessener Wert für die laterale Auflösungsgrenze des Objektivs. Stellen Sie den Zoomfaktor so gering wie möglich (z. B. 10,7). </li><li> Im gleichen Fenster stellen 8 Linie Durchschnitt und 1 Frame durchschnittliche Parameter durch Eintropfen entsprechend die individuell beschriftet Menüs nach unten. Verwenden, um große Werte für ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und kleine Werte für eine schnelle Akquisition. Hinweis: 8-Zeilen-Mittelwerte und 1 Frame Durchschnitt erwirbt qualitativ hochwertige Bilder einer Maus Gehirnhälfte in etwa 4 Stunden. </li><li> Suchen Sie die Probe mit Hilfe der Bühne steuert. Sobald eine repräsentative Feld sichtbar ist, stellen Sie die Verstärkung und Offset. Hinweis: Die Verstärkung und Offset werden im Wesentlichen basierend auf dem Gewebetyp variieren, Fluorophore und / oder anatomischen Merkmal abgebildet wird. Für YFP, stellen Werte von 760 bis 780 für die Verstärkung und von -1,0 bis -1,5 für den Offset. </li><li> Wählen Sie &quot;Kachel-Scan&quot; und wählen Sie die Grenzen der Region von Interesse. Den oberen und unteren Grenzen des z-Stapel zu erwerb. Stellen Sie die Dicke des optischen Abschnitt auf der Basis der optischen Schnittauflösungsgrenze des Ziels. Hinweis: Ein Ziel deroptische Abschnitt Auflösungsgrenze wird in erster Linie durch seine numerische Apertur definiert. Die meisten Mikroskop Steuerungssoftware wird automatisch ein angemessener Wert für die objektive Berechnung verwendet wird. Für einen 10X-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 das wäre etwa 11 um betragen. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Hinweis: Dies kann mehrere Stunden dauern. </li><li> Sammeln Sie Bilder mit höherer Auflösung höherer Vergrößerung Ziele aus bestimmten Regionen von Interesse verwendet wird. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Passive Clearing von Hydrogel eingebettet Gewebe (passive CLARITY) ist eine einfache und kostengünstige Methode für große Gewebestücke zu löschen. Dieser Ansatz erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann leicht in einem temperaturgesteuerten Schüttler durchgeführt werden. Über den Zeitraum von einigen Wochen, auch große, hoch myelinisierten Gewebe, wie eine gesamte Gehirn oder Rückenmark, werden für die Mikroskopie transparent und geeignet sind. Auch wenn dieser Bericht über das Clearing von ZNS-Gewebe konzentriert hat, können passive CLARITY zu jedem Gewebe aufgebracht werden. Die relativen Stärken und Schwächen der optischen Clearing- Techniken 13,17,22, zuvor in der Literatur diskutiert worden, aber sind am deutlichsten in 23 angelegt. Passive CLARITY ist gut geeignet für Experimente, bei denen eine große Anzahl von Proben gelöscht werden gleichzeitig und Reproduzierbarkeit ist von großer Bedeutung. Die Verwendung eines Hydrogels, zusätzlich zu unterstützen, um das Gewebe erleichtert multiple Sondieren des Gewebes. In diesem Bericht wird ein kleines Molekulargewicht Farbstoff, DAPI, wurde gezeigt, aber mehrere Runden von Antikörper-Sondierung sind auch möglich mit diesem Ansatz. Der beschriebene Ansatz weicht die oben von unserem bisher veröffentlichten Protokoll 15 in ein paar wichtigen Punkten. Zum einen in dem aktuellen Ansatz wurden die Proben nicht intrakardial mit Hydrogel perfundiert. Dies war aufgrund der Tatsache, daß das Hydrogel vorzeitig in den Schlauch und Nadeln der Perfusionsapparatur polymerisieren kann, unvollständiger Perfusionen und inkonsistente Clearing führt. Paraformaldehyd fixierten Gewebe in Hydrogel Inkubieren für 7 Tage ist konsistent mit der ursprünglichen Klarheit Protokoll 14, obwohl ein 1 Tag Inkubation für 1 verwendet wird - 3 mm dicke Gewebeschnitte in dem passiven CLARITY Technique (PACT) 17. Zweitens führt dieser Ansatz Lipidentfernung bei einer etwas höheren Temperatur , die zuvor 15-17 berichtet. Höhere Temperature beschleunigt Lipidentfernung, sondern muss gegen die Möglichkeit eines katastrophalen Verlust der Gewebeintegrität (Schmelzen) ausgeglichen werden. Durch die Erhöhung der Inkubationstemperatur von 8 ° C (bis 45 ° C) für 7 Tage und dann mit 3 ° C (bis 40 ° C) für den Rest des Lipidentfernungsprozesses ist Gewebe Clearing- beschleunigt, aber ohne die gleichzeitige Risiko von der Verlust der Gewebeintegrität. Dieser Temperaturanstieg ist mit Temperaturen während der elektrophoretischen Tissue Clearing (ETC) in der ursprünglichen CLARITY Protokoll gemeldet (50 ° C) 14 konsistent. Weiterhin wurde keine Abnahme in der Intensität der transgen exprimierten Fluorophore oder Abnahme der DAPI-Färbung beobachtet. Desoxygenierung ist ein wichtiger Schritt bei der Schaffung des Hydrogels. Das Hydrogel kann in Gegenwart von Sauerstoff in dem Hydrogel-Lösung gelöst polymerisieren, aber in unseren Händen die Geschwindigkeit und Vollständigkeit der Polymerisation war viel variabler ohne deoxygenation. Wenn die hydrogel nicht polymerisieren nicht der häufigste Grund ist die Anwesenheit von Sauerstoff in dem Hydrogel. Die optische Clearing-Prozess bemerkenswert einfach ist, jedoch zu implementieren, dass die Mikroskopie folgt kann ziemlich kompliziert sein. Von entscheidender Bedeutung sind die das Gewebe abzubilden Ziele. Der Arbeitsabstand eines Objektivs definiert die Tiefe, dass es Bild in einer Gewebeprobe. Ein Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 2 mm kann nur Bild 2 mm in eine Probe, muss daher der Arbeitsabstand einer Objektiv größer sein als die Dicke der Probe, um sie vollständig zu Bild. In ähnlicher Weise stellt die numerische Apertur einer Objektiv eine Begrenzung der Größe von Funktionen, die es lösen können sowohl in der Ebene als auch die Dicke der optischen Abschnitte, die es sinnvoll zu erwerben. Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) und Lichtblatt-Mikroskopie (LSM) kann durch die Art der Beleuchtung, die Beschränkung auf optische Schnittdicke zu überwinden, aber diese Mikrosmeistert sind nicht überall verfügbar. Hohe numerische Apertur, großen Arbeitsabstand Ziele sind selten und teuer, aber notwendig sind, um für hohe Bildqualität von großen optisch gelöscht Abschnitte. Sobald die Bilder erfasst wurden, sind sie oft sehr groß ist, für eine niedrige Auflösung von mehreren hundert MB Bereich (sowohl in der Ebene als auch der z-Richtung) Bild zu einigen TB für ein hochauflösendes Bild auf einem LSM gesammelt. Die Computer für die Bildanalyse verwendet werden, erfordern nicht nur viel Stauraum, aber große Mengen an Direktzugriffsspeicher (RAM) für die Bildverarbeitung. Software - Pakete geeignet für die Analyse von großen optisch gelöscht Bild Bände umfassen Amira, Imaris und ImageJ 14-16. Unter den Grenzen dieses Ansatzes erfordert passive CLARITY mehr Zeit Gewebe als andere optische Clearing Ansätze zu löschen. das Volumen des Gewebes abnimmt, indem es Trimmen gelöscht werden oder in kleinere Stücke können sectioning ACCELerate Lipid-Entfernung. Auch wird wiederum Abnahme Vernetzung der Konzentration von Paraformaldehyd in dem Hydrogel verringert und die Hydrogel Porengröße zu erhöhen, zu einer schnelleren Clearing führenden 17, obwohl dies zu einer größeren Gewebeexpansion führen kann, können einzelne Experimentatoren feststellen , dass es sich lohnt, die Abnahme der Lichtung Zeit. Weiterhin mit TDE als Klärungsmittel kombiniert, kann die Menge des gesamten Gewebeexpansion begrenzt werden. Obwohl dieser Bericht die Verwendung von kleinen Molekulargewicht Farbstoffe beschreibt, Sondieren Antikörper ist eine sehr natürliche nächste Schritt. Die Anwesenheit des Hydrogels bietet nicht nur körperliche Unterstützung für die gelöscht Gewebe, sondern dient auch als ein Hindernis für das Eindringen von Antikörpern tief in das Gewebe. Eine Verringerung der Acrylamidkonzentration oder die Paraformaldehydkonzentration wird die Porengröße in dem Hydrogel zu erhöhen, zu erleichtern (und damit die Beschleunigung) Antikörper 17 Penetration, aber dies hat eine schädliche Wirkung auf tissue Expansion. Dennoch können Antikörper Sondieren von Blöcken von Gewebe in wenigen Tagen erreicht werden und ganze Gehirn in ein paar Wochen das Acrylamid und Paraformaldehyd Konzentrationen in dem ursprünglichen Bericht 14 beschrieben ist . Optische Clearing- Techniken ermöglichen einen tief in das Gehirn zu sehen, Förderung des Verständnisses der Struktur und Funktion. Diese neuen Werkzeuge ermöglichen es den Forschern, das Gehirn auf zellulärer und molekularer Auflösung sichtbar zu machen, unser Verständnis dieser komplexen Organen zu erhöhen.

The ability to image complete neuroanatomical structures is immensely valuable for understanding the brain in health and disease. Traditionally, 3D imaging has required tissue sectioning to provide the axial resolution and to visualize deep anatomical structures. This approach can produce high-resolution data sets, but requires sophisticated image reconstruction techniques and is very labor intensive. As a result, it has been limited to the imaging of small volumes of tissue1-3. Optical sectioning, on the other hand, is well suited for the creation of high-resolution 3D images of fluorescently labeled tissues. Since optical sectioning is inherently three dimensional, it does not require extensive computation to produce a 3D image volume. However, light scattering and tissue opacity limit the depth at which tissues can be optically sectioned. The depth of imaging is limited to about 150 &#181;m in laser scanning confocal microscopy and to less than 800 &#181;m using two-photon excitation microscopy4-8.
In order to overcome these limitations, several optical clearing techniques have been recently developed and then further refined to permit the deep microscopic imaging of intact tissues. The use of benzyl alcohol and benzyl benzoate (BABB) to render fixed tissues transparent was among one of the earliest approaches9. However, this approach was limited by the quenching of fluorescence in the samples and incomplete clearing of highly myelinated structures10. Refinements of this technique, such as 3D Imaging of Solvent Cleared Organs (3DISCO), have led to very rapid and complete tissue clearing, but still suffer from rapid loss of fluorescent signals, especially yellow fluorescent protein (YFP)10. Water-based clearing solutions, such as Sca/e11 and SeeDB12, preserve fluorescent signals, but do not completely clear highly myelinated tissues. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) is a promising new optical clearing technology that appears to overcome the limitations of previously developed water-based clearing solutions13. In contrast with other optical clearing techniques, Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 embeds the brain in a porous matrix that provides structural integrity to proteins, nucleic acids and small molecules, while leaving lipids unbound. The lipids are then removed electrophoretically, culminating in an optically cleared brain that can be easily visualized and equally easily probed using commonly available techniques.
Electrophoretic tissue clearing (ETC) is used to remove lipids from hydrogel embedded tissues in CLARITY, however, ETC can be difficult to implement consistently and tissues subject to electrophoresis can exhibit tissue distortion, browning, loss of fluorescence and antibody reactivity. Passive lipid clearing avoids these limitations, but requires increased clearing times15-17. Passive clearing also permits the clearing of large numbers of samples in parallel, since it is not limited by the number of ETC apparatuses available. Decreasing the concentration of paraformaldehyde and excluding bis-acrylamide from the hydrogel have led to great increases in the speed of clearing at the expense of greater tissue expansion16. Less expensive alternatives to the refractive index matching solution used in the original CLARITY technique have been developed17-19. 2,2'-thiodiethanol (TDE) is an inexpensive and rapid brain clearing agent that reverses some of the tissue expansion that occurs during lipid removal18. This report incorporates passive clearing of hydrogel embedded tissue and the use of TDE as a refractive index matching solution to the original CLARITY technique to produce a highly reproducible and inexpensive protocol for the optical clearing of the mouse central nervous system.

<table><tbody><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>buffers</td></tr><tr><td>32% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-5</td><td>perfusion and hydrogel</td></tr><tr><td>2,2&#039;-thiodiethanol (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>refractive index matching solution</td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>VA-044 initiator</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>preservative</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>perfusion</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>perfusion</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>nuclear stain</td></tr><tr><td>99.9% isoflurane</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Hydrocholoric acid</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Willco dishes</td></tr><tr><td>Reusable adhesive</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>Silicon elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>Lint-free wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Mouse brain matrix</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>sectioning tissue</td></tr><tr><td>Matrix blades</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>sectioning tissue</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>microscopy</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>microscopy</td></tr></tbody></table>

optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

die strukturelle Organisation des Gehirns sichtbar machen ist entscheidend für das Verständnis, wie die Morphologie und Konnektivität Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit beeinflussen. Optische Clearing-Techniken machen es möglich, Bildzellpopulationen in 3D in intakten Geweben, so dass wir kohäsiv Morphologie und Konnektivität zu studieren. Mäuse, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, angetrieben durch spezifische Promotoren Subpopulationen von Zellen ein ermöglichen, die komplexen Muster der neuronalen Verbindungen im Gehirn zu necken auseinander. THY1-YFP transgene Mäuse wurden ausführlich in der optischen Clearing- Literatur verwendet , da diese Mäuse in einer Untergruppe von Projektionsneuronen YFP exprimieren, die in der Großhirnrinde und des Hippocampus befinden, sowie andere Strukturen im Gehirn (2a &amp; b). Darüber hinaus YFP + Rindenschicht V Neuronen projizieren durch den corticospinal - Darm - Trakt in den spinal Kabel (Abbildung 2c und d), so dass sie sehr nützlich bei der Beurteilung der Wirkung der axonalen Beleidigung und / oder Verletzungen im Rückenmark auf die kortikale Neuronen 15 zu machen. Durch die Verwendung der konfokalen Mikroskopie und optische Schnitte von optisch gelöscht Geweben kann man leicht Unterschiede in neuronal Dichte über große anatomische Strukturen zu bewerten. Zusätzlich zu THY1-YFP-transgenen Mäusen kann eine beliebige Anzahl von transgenen Mäusen, abgebildet werden. PLP-EGFP transgenen Mäuse exprimieren im gesamten Gehirn und Rückenmark (Abbildung 3a) grün fluoreszierende Protein (EGFP) in reifen Oligodendrozyten exprimieren Proteo Protein (PLP) verbessert. PV-tdTomato transgenen Mäuse exprimieren tdTomato in einer Untergruppe von Parvalbumin (PV) Exprimieren Inter im Cerebellum, Striatum und Hippocampus (Abbildung 3b). Auch in Mäusen, die nicht exprimieren fluoreszierendes Transgenen, niedermolekulare fluoreszierende Farbstoffe, wie zum Beispiel DAPI kann leicht diffundieren in Hydrogel eingebetteten Geweben und erlauben die Bewertung der Zellkerne im Gehirn (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig1.jpg" /> Abb . 1: Verschiedene Phasen der Gehirn Clearing Fotografie von THY1-YFP + Gehirn der Maus , die aus dem Schädel (a) entfernt wurde. Fotografie von Hydrogel eingebettet THY1-YFP + Maus Gehirnhemisphäre (b). Fotografie von THY1-YFP + Maus Gehirnhemisphäre nach Lipidentfernung (c). Maßstabsbalken sind 5 mm in jeder Platte. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig2.jpg" /> Abbildung 2: THY1-YFP - Expression im Gehirn einnd Spinal Cord. THY1-YFP + Neuronen in der Großhirnrinde und des Hippocampus bei 5fache Vergrößerung abgebildet und rekonstruiert in 3D (a). Ein maximaler Intensitätsprojektion eines 10fach-Bildstapel der Hirnrinde die dendritische arborization der Rindenschicht V Pyramidenneuronen (b) zeigt. THY1-YFP-Expression in einer intakten Hals- und Brustrückenmark bei 5fache Vergrößerung abgebildet und rekonstruiert in 3D (c). Ein maximaler Intensitätsprojektion eines 10fach-Bildstapel des Rückenmarks zeigen einzelne Axone (d). Maßstabsbalken sind 1 mm in (a), 100 &amp; mgr; m in (b), 2 mm (c), und 100 &amp; mgr; m in (d). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig3.jpg" /> Abbildung 3: PLP-EGFP und PV-tdTomato Expression im Gehirn. </strong&gt; PLP-EGFP-Expression in einer 2 mm dicken Abschnitt koronalen Gehirn bei 5fache Vergrößerung abgebildet (a). Dieses Bild ist in etwa 1 mm von der Oberfläche des Gewebeschnittes. PV-tdTomato Ausdruck im Cerebellum einer intakten Hirnhemisphäre abgebildet bei 10-facher Vergrößerung (b). Dieses Bild ist etwa 0,5 mm von der Midsagittalebene. Maßstabsbalken sind 1 mm in (a) und 250 &amp; mgr; m in (b). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig4.jpg" /> Abbildung 4: DAPI - Färbung im Gehirn DAPI Ausdruck im Cerebellum einer intakten Hirnhemisphäre bei 5fache Vergrößerung abgebildet.. Das Bild ist in etwa 1 mm von der Medianebene. Der Einschub zeigt die Detailebene sichtbar bei diesem Abbildungstiefe bei 10-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken einre 250 &amp; mgr; m in der Hauptkonsole und 50 &amp; mgr; m im Einsatz. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Puffer </td><td> Chemisch </td><td> Die Endkonzentration </td></tr><tr><td> Perfusions - Lösung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Natriumnitrat </td><td> 0,5% w / v </td></tr><tr><td></td><td> Heparin </td><td> 10 U / ml </td></tr><tr><td> Fixierlösung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyde </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td> Hydrogellösung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyd </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Acrylamide </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Bis-Acrylamid </td><td> 0,05% v / v </td></tr><tr><td></td><td> VA-044-Initiator </td><td> 0,25% w / v </td></tr><tr><td> Clearing - Puffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Borsäure </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td></td><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> 4% w / v </td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Natriumazid </td><td> 0,1% w / v </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Puffer und Lösungen.

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Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Serie: Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Immunologie und Infektion

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Biologie

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...