This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

HINWEIS: Ethics Statement: Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of California, Irvine, Protokoll # 2010-2943 genehmigt. 1. Entfernen des Rückenmarks <ol><li> Zeigen Papierhandtücher mit ~ 100% Flüssigkeit Isofluran USP benetzt in euthanizing Kammer und legen trockenen Papierhandtücher auf. Zeigen Maus in Kammer auf der Oberseite des trockenen Papiertüchern so Maus die Isofluran nicht berühren, und sicherstellen, dass die Kammer bedeckt. Frühestens nach einer Minute nach dem Atemstillstand zu gewährleisten, dass die Maus euthanasiert. </li><li> Führen Sie einen Rückendurchtrennung des Halses, um sicherzustellen, wird die Maus getötet. Haben einen Genickbruch nicht durchführen, da dies das Rückenmark beschädigt werden. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das nasse Haar. </li><li> Scharfe Feine Schere, um die Haut und Haar von der Rückseite der Maus zu entfernen, um die Wirbelsäule von etwa Gebärmutterhalskrebs Lamina 1 aussetzen (C1) Zu sakralen Lamina 4 (S4). </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 10 Klinge, stellen Schnitte auf der linken und rechten Seite der Wirbelsäule, um es von Muskeln und Fett zu trennen. Dadurch wird die Entfernung von dem Rückenmark erleichtert. </li><li> optional: eine gekrümmte Luer Rongeure kann zur Schaufel entfernt zusätzliche Fleisch werden. </li><li> Halten Sie die Spitze der Wirbelsäule mit Wellen Graefe Pinzette, legen Titan gebogenen Vannas Schere mit der gewölbten Seite nach oben in das freiliegende Wirbelsäule an C1, man aufpassen, das Rückenmark nicht zu berühren. </li><li> Schieben Sie den Titan gebogenen Vannas Schere ganz nach rechts und machen einen kleinen Schnitt. Eine kleine Crunch-Sound zu hören sein und fühlte, wie die Schere die Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schnitt auf der äußersten linken Seite des Kabels. Achten Sie darauf, nicht zu schnell zu gehen oder zu groß, von einem Schnitt, da dies das Risiko eine Beschädigung der Schnur mit der Schere. </li><li> Die einzelnen Plättchens sollte mit der Pinzette angehoben, nachdem die Seiten der Wirbelsäule geschnitten zu werden. REPEAT Sie diesen Schritt für jede Schicht bis S4, weiterhin zu halten und ziehen Sie die Rückenmarkswirbel. Hinweis: die Wirbel oberhalb der Transplantatstelle wahrscheinlich ab, wenn man ihn auf die Transplantatstelle geschnitten kommen. Fahren Sie den Vorgang ab knapp unter der Transplantation Website. </li><li> optional: legen Sie den Wirbel nach unten um zu sehen, wo die Transplantation Website hat und zu messen und schneiden ~ 20 mm rostral und kaudal der Transplantation Website. HINWEIS: Bei der Transplantation von NPCs mehr nicht als transplantierten NPC benötigt in der Regel nicht weiter migrieren als 15 mm sein. Die Höhe der Wirbelsäule benötigt wird abhängig vom Experiment und Migrationseigenschaften der Zelltyp verpflanzt. Machen rostralen und kaudalen Schnitte, die zur Transplantation Website gleich weit sind die Transplantation Website, um während der Bildgebung leichter entfernt werden können. </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge sorgfältig geschnitten Ganglien auf der rechten und linken Seite der Bauchseite der Wirbelsäule ausgehend von der rostralen Ende. Dies wkrank ermöglichen das Rückenmark aus dem ventralen Wirbel leichter entfernt werden. HINWEIS: Fertig schnell (Schritte von 1,7 bis 1,11), wird das Rückenmark nicht austrocknen. Allerdings kann 1x PBS auf die Schnur verabreicht werden, um sie feucht zu halten. </li><li> Drehen Sie die Maus und halten Sie die Maus nach oben, damit das Rückenmark nach unten zeigt. Schieben Sie vorsichtig das Rückenmark mit geschlossenen gezackten Graefe Pinzette. Ohne nicking das Rückenmark, sorgfältig geschnitten verbleibende Ganglien, damit das Rückenmark in einem einzigen intakten Stück angehoben werden. </li><li> Stellen Sie sicher, das Rückenmark in RPMI-1640 und auf Eis für den Transport zum 2P Mikroskop. </li></ol> 2. Herstellung von Spinal Cord for Imaging <ol><li> Einbetten des Rückenmarks in Agarose <ol><li> Halten Sie die isolierten Rückenmark in gekühlt RPMI-1640 auf Eis vor der Bildgebung. </li><li> Abwiegen Agarose (niedrige Geliertemperatur) und euch eine 5% ige Lösung in 5 ml 1x PBS. Mikrowelle den 5% igen Lösung für 15 Sekunden, um den ag lösenmachte sich auf und lassen Sie die Lösung abkühlen auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie das Rückenmark, indem Sie sie auf ein Blatt Parafilm mit der Bauchseite nach oben ein. </li><li> Pipette ca. 5 ml 5% Agarose-Lösung über die Bauchseite der Wirbelsäule. Lassen die Agarose verfestigt durch Abkühlen auf Raumtemperatur. Voll Erstarrung dauert ca. 5 min. </li><li> Eine dünne Schicht von Gewebekleber auf eine 22 mm Quadratdeckglas. </li><li> Kehren Sie die eingebettete Rückenmark, indem die Bauchseite auf Parafilm. Die Rückenseite wird nun nach oben zeigen. Halten Sie das Deckglas auf der Rückenseite, und tauchen Sie die Agarose eingebettet Rückenmark / Deckglas Vorbereitung in RMPI, den Klebstoff zu verfestigen. Entfernen Sie das überschüssige erstarrte Agarose mit einer Rasierklinge. </li></ol></li><li> Montage des Rückenmarks auf dem Mikroskoptisch <ol><li> Vaseline auf die Unterseite des Deckglases. Dies stabilisiert die Vorbereitung während der Perfusion. </li><li> Stellen Sie das Rückenmark Zubereitung in eineAbbilden und auf dem Mikroskoptisch mit der ventralen Seite nach oben in Richtung des 25X Tauchobjektivseite. Die speziell angefertigten Bild auch ca. 20 mm tief, 50 mm lang und 50 mm breit. </li><li> Bild während Superfusion der Vorbereitung mit wärmten (37 ° C), mit Sauerstoff angereichert (95: 5 Sauerstoff: Kohlendioxid-Carbogen) RPMI-1640-Medium ohne Serum. <ol><li> Vorwärmen Medien bis 37 ° C im Wasserbad und an der Schlauchpumpe, indem Sie den Schlauch in die Medienflasche. </li><li> Behalten die Flüssigkeitstemperatur bei 37 ° C eine Heizvorrichtung an der Verbindung der Rohrleitung mit der Kammer. Superfuse Medium durch gut bei 3 ml / min unter Verwendung von Schläuchen auf die Schlauchpumpe (1B) verbunden ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P Imaging des ventralen Rückenmark <ol><li> Mikroskop-Setup <ol><li> Erwerben Sie Bilder von Thy1-eYFP Rückenmark mit einem Chameleon Ultra-Ti: Saphir-Laser bis 900 nm eingestellt. Dämpfen Laserleistung auf dieProbe auf &lt;5%, um minimale Phototoxizität 16 zu gewährleisten. Haltetemperatur durch Perfusion sauerstoff perfundiert RPMI-1640 mit einer konstanten 37 ° C unter Verwendung einer einzelnen Inline-Lösung Heizvorrichtung stabile Bildgebung zu gewährleisten und um Gewebe Drift und Zellschäden zu verhindern. </li><li> Um eGFP und eYFP Fluoreszenzsignal zu trennen, setzen Sie ein 520 nm Single-Rand dichroitischen und eine 560 nm Single-Rand dichroitischer Strahlteiler in Reihe 2P Emission in drei Kanäle zu trennen, absichtlich Spaltung der grüne Emission, um die Sichtbarkeit zu verbessern. HINWEIS: Diese Kanal werden als blau-grün (Mission &lt;520 nm), grün-gelb (520-560 nm) und rot (Emissions&gt; 560 nm) bezeichnet. Photomultiplierröhren detect emittierte Licht in jedem Kanal. </li></ol></li><li> Lokalisierung Bildgebung Bereiche von Interesse <ol><li> Mit dem Okular und eine Hellfeld-Lichtquelle, konzentrieren sich die Tauchziel am ventralen Rand des Rückenmarks, ein Referenzpunkt gesetzt. </li><li> Stellen Sie sicher, Umgebungslichtquelle ausgeschaltet ist und swJuckreiz an 2P Anregung durch Öffnen der Laserverschluß. </li><li> Falls verfügbar, bei der Suche Gewebe für Bereiche von Interesse, verwenden Sie eine niedrigere Auflösung, höhere Lautstärke ohne Digitalzoom und eine höhere Abtastrate als beim Erwerb von endgültigen Bilder. Typische Einstellungen mit diesem System bei der Suche Gewebe für eine Region von Interesse sind: Auflösung: 256 Pixel; Volumen: x = 600 &amp; mgr; m, y = 600 um, z = 0 bis 300 &amp; mgr; m. </li><li> Beachten Sie die eYFP Axone in der Nähe des ventralen Rand des Rückenmarks. Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen (blau) am hellsten in der Rückenmarksgewebe Rand. Suchen Sie die eYFP Axone nur auf die zweite harmonische Signal dorsal aus dem Kollagen und eYFP Signal wird in der grün-gelb Kanal visualisiert. </li><li> Finde die Transplantatstelle in der Längsmitte des Rückenmarks Präparation 14. Bei Mäusen 1 Tag nach eGFP-NPC-Transplantation, suchen Sie die Transplantation Website durch die Fokussierung des Strahlengangs in der z-Ebene tief in das Gewebe. Die Transplantation Website will unterscheiden sich leicht zwischen den Tieren, sondern ist in der Regel ~ 200 &amp; mgr; m von der ventralen Rand entfernt. Beachten Sie die Cluster von eGFP-NPCs in der weißen Substanz Wege, näher an der ventralen und Seitenränder in Mäusen nach Tag 1 nach der Transplantation. </li></ol></li><li> Der Erwerb endgültigen Bilder <ol><li> Erwerben Bildauflösung von 512 Bildpunkten; Volumen: x = 270 &amp; mgr; m, y = 212 &amp; mgr; m und z = 100 &amp; mgr; m mit 6 Slidebook Software. Kompilieren z-Stacks durch den Erwerb von sequenziellen Fokusebenen in Schritten von 2,5 um. </li><li> Führen Sie eine bidirektionale Abtastung mit der richtigen Zeilensprung-Offset, um eine schnelle Quantifizierung eventueller Migrieren von Objekten im Rückenmark zu gewährleisten. Sicherzustellen, dass die ideale Erfassungsbildrate zellulären Geschwindigkeit zu bestimmen, innerhalb des Rückenmarks ist ungefähr 1 Rahmen / sec. HINWEIS: Imaging-Einstellungen können auf individuelle Benutzereinstellungen, wie beispielsweise Erfassungsbildrate, Bildauflösung und Bildmengen geändert werden. Größere Bildmengen werden in der Regel länger, um in einem giv erwerbenen Auflösung. </li><li> Analysieren, Ernte, glatt und Pseudoslidebook-Bilddateien mit Bildanalyse-Software wie Bitplane Imaris 7.7. Produzieren letzte Zeitraffer-Videos durch Kämmen aufeinanderfolgenden Bildgebungsvolumen mittels eines automatisierten Verfahrens in Slidebook und Imaris. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing interests.

Echtzeit-2P Bildgebung von intaktem Gewebe ist erforderlich, um NPC Kinetik und Interaktionen nach der Transplantation in die demyelinisierten Maus Rückenmark zu untersuchen. Intravital Imaging-2P wird häufig verwendet, um zelluläre Dynamik auf der Rückenseite des Rückenmarks in lebenden Mäusen zu bestimmen und wurde genutzt, um Rücken Demyelinisierung in demyelinisierende Erkrankung 17-19 studieren. Da transplantierte NPCs wandern zur ventralen weißen Substanz, die zu tief, um Bild in situ mit 2P-Mikroskopie liegt, ist notwendig, aber eine ex vivo Vorbereitung. Diese Methode wurde in unserem Labor verwendet worden, um die Beweglichkeit und die Remyelinisierung Kinetik NSC in dem beschädigten und nicht beschädigten Wirbelsäule 6 transplantiert bestimmen. Ex vivo Zubereitungen ermöglichen Abtastung Rückenmark nicht nur in Längsrichtung sondern auch in Querrichtung von der Ventralseite 6,20 . Dies ermöglicht die Analyse der Unterschiede in der Zellbewegung (Geschwindigkeit und Richtung) und Wechselwirkungen an der transplant Seite, angrenzend an die Transplantationsstelle und in verschiedenen Abständen von der Transplantatstelle 6. Während wir ursprünglich entwickelt diese Vorbereitung zur Bild transplantiert eGFP-NPCs auf der Bauchseite des Rückenmarks, kann es zu Bild verwendet werden jede fluoreszenzmarkierten oder gefärbte Zelle, die von der ventralen, dorsalen oder lateralen Seite durch Änderung der Orientierung das Rückenmark montiert. Vorteile dieser Zubereitung über Intravital Imaging sind erlaubt Bauchseite Bildgebung und ohne die Notwendigkeit für Anästhesie und das Überleben der Operation, die noch mit den neuen Intravitalpräparate mit einem &quot;Glasfenster&quot; Setup, das für mehrere Imaging-Sitzungen ermöglichen ohne wiederholte Operationen 19,21 gebraucht wird . Es sollte angemerkt werden, dass eine Beschränkung dieses Verfahrens gegenüber dem &quot;Fenster Ansatz in Kombination mit intravitalen Bildgebung ist die Unfähigkeit zu mehreren Zeitpunkten aus einer Maus erhalten, da das Rückenmark entfernt und die Maus euthanasiert. 2P-Bildgebung eignet sich ideal für die Lösung der Dynamik der einzelnen Zellen im intakten Geweben 22,23 geeignet. 2P Anregungs nutzt Nahinfrarot-Photonen, die über einen längeren Zeitraum von tiefen Gewebeabbildung mit minimaler Photo ermöglichen. 2P Anregung erfolgt bei der gleichzeitigen Absorption von zwei Photonen durch ein Fluorophor. Die hohe Konzentration von Photonen für 2P Anregungs notwendig durch raum-zeitliche Komprimierung der Laserausgangs 2P an einer einzigen Brennebene erreicht. Dies schränkt Fluoreszenzanregung auf den Brennpunkt, weiter minimiert Phototoxizität in Rückenmark Regionen außerhalb der Brennebene. Nah-Infrarot-Photonen auch Streuung verringert, wodurch Abbildungs ​​bis zu etwa 300 &amp; mgr; m von der ventralen Seite des Rückenmarks 16. Wie bei jeder neuen Technik ist jedoch 2P Bildgebung des explantierten Rückenmark hat Einschränkungen, die beachtet werden müssen. Diese Bildgebungsprotokoll verwendet eine 520 nm dichroic Spiegel, der Trennung von eGFP und eYFP Fluoreszenz ermöglicht durch die Umleitung eGFP Emission in die Leuchtstoffkanal in der Regel für blaues Licht vorbehalten. Erzeugung der zweiten Harmonischen von Kollagen in das Rückenmark erstellt wird auch im blauen Kanal, doch ist ohne weiteres von eGFP-markierten Zellen, die identifizierbare im grün-gelben Kanal wie in dieser Zubereitung deutlich heller sind und über einen Teil ihrer Emissions Kollagen nicht. Diese Technik der Kanalmischung und Trennung der verschiedenen Abschnitte eines Emissionsspektren mit spezifischen dichroitische ist oft nützlich für die visuelle oder automatisierte Identifizierung einzelner Fluorophore mit engen oder nahezu überlappenden Emissionsspektren. Phototoxizität ist eine weitere Einschränkung dieses 2P Bildgebungsprotokoll. Zellen innerhalb eines einzelnen Abbildungsvolumen sind empfindlich gegen Phototoxizität; daher sollte Experimentator voll im Klaren über Anzeichen von Phototoxizität werden. Phototoxizität ist typischerweise zunächst deutlich in der Verringerung oder mangelnde ZellBeweglichkeit, durch Photobleaching und / oder morphologische Veränderungen in lokalen Geweben gefolgt. Verschiedene Faktoren können die die zu Phototoxizität oder dass es zum Live-Cell-Imaging geeignet Gewebe schädigen. Es ist entscheidend, um die Laserleistung und der Temperatur und Sauerstoffversorgung des perfundierten RPMI-1640 zu überwachen. Es ist auch unerlässlich, um die ordnungsgemäße Entfernung des Rückenmarks von der Maus, ohne übermäßige Dehnung oder Stauchung der Wirbelsäule und ohne Abschneiden des Rückenmarks mit den Klingen zu gewährleisten. Bei sachgemäßer Verwendung wird die explantiert Rückenmark Vorbereitung lebensfähig für bis zu 10 Stunden bleiben, wie robust zellulären Motilität im ventralen Rückenmark ohne Verringerung bei 10 Stunden nach der Extraktion bestimmt. Eine Vielzahl von Gewebe extrahiert wird häufig für lange Zeiträume abgebildet und als lebensfähig 23-26. Daher ist die Quantifizierung von Zelldynamik in mehrere Bereiche innerhalb einer einzigen Wirbelsäule möglich. Schließlich sei darauf hingewiesen, dass die überwiegende Mehrheit der Zellen That nicht fluoreszenzmarkierten wird durch diese Zubereitung (es sei denn natürlich autofluoreszierenden) sichtbar gemacht werden, und es ist wichtig zu erkennen, dass die markierten Zellen werden mit einem komplexen Umfeld von anderen nicht markierten, scheinbar unsichtbar körpereigenen Zellen und Strukturelemente interagieren.

Mausmodelle der Demyelinisierung, einschließlich experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und intrakranielle Infektion mit neuroadapted Maus-Hepatitis-Virus (MHV), sind ausgezeichnete Werkzeuge zur molekularen Signalwege und zellulären Interaktionen mit der Krankheit zu studieren. Sie haben dazu geführt, und unterstützt die Wirksamkeit der FDA zugelassenen pharmazeutischen Therapien, die sich vornehmlich an Einstellung der Autoimmun- und Entzündungs ​​1. Sobald jedoch endogenen Remyelinisierung ausgefallen ist, die gegenwärtig zugelassenen Therapien nicht wirksam beheben demyelinisierten Läsionen im zentralen Nervensystem. Daher sind die Reparaturorientierten Therapien in diesem Stadium der Erkrankung kritisch für die Linderung von chronischen Symptomen und Verbesserung der Lebensqualität. In letzter Zeit wurden neurale Vorläuferzellen (NPCs) in den Vordergrund als eine mögliche regenerative Therapieform gekommen, um Bereiche der Entzündung und Demyelinisierung Ziel. Mehrere Studien haben die Fähigkeit der NPCs zu endogeno induzieren hervorgehobenRemyelinisierung uns und machen Sie direkt in die Remyelinisierung 2-8. Da NPCs in direktem Remyelinisierung beteiligt sind, ist es unerlässlich, die Kinetik und Wechselwirkungen mit körpereigenen Zellen nach der Transplantation zu verstehen. Nach der Transplantation, wandern NPCs ventral Bereichen der weißen Substanz Schaden, dann rostral und kaudal in Bezug auf die Transplantatstelle 5,9. Die Kinetik der Migration unterschiedlich in Reaktion auf Umweltreize; NSC in einen nicht beschädigten Rückenmark transplantiert größere Geschwindigkeiten als NSC in einen beschädigten Bandkabel 6 transplantiert. Nach einer Wanderungsperiode übertragen NSC proliferieren umfassend, mit einer höheren Geschwindigkeit in einer beschädigten Wirbelsäule relativ zu intaktem Rückenmark 6. Schließlich sind die meisten NPCs differenzieren sich in Oligodendrozyten und initiieren direkten Remyelinisierung 4,6,9. Die demyelinisierten Läsion ist komplex und kann eine vielfältige Population von Zellen in verschiedenen Stadien einer umfassenctivation. Zum Beispiel kann ein aktiver Multipler Sklerose (MS) Läsion eine signifikante Population von aktivierten T-Zellen, M1 Mikroglia und M1 Makrophagen, aber eine chronische Stumm MS Läsion kann hauptsächlich aus reaktiven Astrozyten mit wenig Entzündungszellen 10-13 umfaßt, umfassen. Aufgrund der Vielfalt von Effektorzellen, Zwei-Photonen (2P) Bildgebung in Mausmodellen der Demyelinisierung ist ein äußerst nützliches Werkzeug zur besseren Verständlichkeit lokalen zellulären Interaktionen innerhalb der Läsion. MS und vielen intensiv genutzt MS Forschungsmodellen wird die Mehrzahl von Läsionen an der Bauchseite des Rückenmarks, einer Region unzugänglich intravitalen 2P Abbildungs ​​aufgrund Läsionstiefe und dem hohen Lipidgehalt des Rückenmarks. Um diese Probleme und Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb Läsionen entlang der ventralen Rückenmark umgehen haben wir ein einfaches ex vivo 2P Abbildungs ​​Zubereitung 6 entwickelt. Diese Studie folgt auf eine frühere Veröffentlichung Methoden, die zeigten,die Prozedur zur Verpflanzung enhanced green fluorescent protein (eGFP) exprimierenden NSC in das Rückenmark von Mäusen nach JHMV Stamm von MHV-induzierten Demyelinisierung 14. Fünf Wochen alten Mäusen mit JHMV infiziert und mit eGFP-NPCs transplantiert bei thorakalen Ebene 9 am Tag 14 nach der Infektion. Die hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Extrahieren des Rückenmarks, geben Sie ein Ex-vivo-Agarose Vorbereitung und Bild transplantiert eGFP-NPC-Interaktionen mit verbesserten gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) exprimierenden Axone. Mäuse, eYFP unter der neuronalen spezifischen Thy1 Promotor In diesem Verfahren wurden 15 verwendet. Nur ein Teil der Axone zum Ausdruck eYFP, so dass es nützlich für die Abbildung einzelner Axone. Hier zeigen wir, Rückenmark nach 7 Tagen nach der Transplantation entfernt; jedoch kann das Rückenmark zu jedem Zeitpunkt nach der Transplantation gewonnen werden. Während wir zeigen, Wechselwirkungen von NPCs mit beschädigten Axone können unsere Protokoll in Kombination mit genetischen Fluoreszenzmarker eingesetzt werdenvon anderen Zelltypen in einer Vielzahl von zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark der Maus vorkommen untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>sharp</td></tr><tr><td>scalpel blade #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (tissue adhesive)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm square cover slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X dipping objective, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>photomultiplier tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L variable-speed tubing pump</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>digital thermometer</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> Während die explantiert Rückenmark Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden, um jede Fluoreszenz innerhalb des Rückenmarks zu visualisieren, unser Vertreter Ergebnisse zeigen eGFP-NPC-Interaktionen mit eYFP-Axone. Zunächst zeigen wir die eingebetteten ventralen Rückenmark Zubereitung in 1A. Als nächstes zeigen wir die 2P Mikroskopaufbau und Schlüsselkomponenten in der 1B, Fig. 2 zeigt eGFP und eYFP Fluoreszenz in einem Z-Stapel innerhalb des ventralen Rückenmark. Erwerb von aufeinanderfolgenden Z-Stapel können zusammengestellt werden, um Zeitraffer-Videos zu produzieren, um Echtzeit-Zelldynamik im intakten Gewebe analysieren. Mit einem 520 nm Single-Rand dichroitischen und 560 nm Single-Rand dichroitischer Strahlteiler, wie im Protokoll angegeben, kann eGFP und eYFP Signal zu trennen. Einzelne Kanäle können pseudocolored werden grün und gelb mit Imaging-Software. 80 / 52580fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Rückenmark und Mikroskopaufbau. (A) Eine Rückenmark in einem 5% igen Agarosegel (links) eingebettet und auf einem Deckglas nach der Entfernung von überschüssiger Agarose (rechts) angeordnet ist. (B) Ein Bild der Mikroskopaufbau mit wichtigen Komponenten markiert. 1. Wasser bei 37 ° C eingestellt. 2. vorgewärmte RPMI-1640. 3. C / L drehzahlvariablen Pumpenschlauch. 4. Single Inline-Lösung Heizung. 5. Tauchziel. 6. Digital-Thermometer. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52580/52580fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52580/52580fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiel 2P Bild innerhalb des ventralen Rückenmark gewonnenen 3D-Rekonstruktionen der ventralen Seite einer nicht infizierten, nicht beschädigt wird (A) und JHMV infizierten, demyelinisierten (B) des Rückenmarks.von einem Thy1-eYFP Maus nach der Transplantation mit eGFP markierten NPCs. Fluoreszenz-markierte Axone pseudocolored gelb und NPCs sind grün pseudocolored. Bildauflösung: 512 Pixel; Bildvolumen: (A) x = 239 &amp; mgr; m, y = 259 &amp; mgr; m, z = 65 &amp; mgr; m, die unter Verwendung 26 z-Stapel beabstandet 2,5 um voneinander und (B) x = 497 &amp; mgr; m, y = 389 &amp; mgr; m, z = 127,5 &amp; mgr; m, die unter Verwendung 51 z-Stapeln Abstand 2,5 um voneinander entfernt sind.

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Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Aufrufe.  University of California, Irvine.  Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark. 

Serie: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Biotechnik

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Zusammenfassung

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