Name: layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization at JoVE.com

This work was supported by grants from the National Institutes of Health, including a microphysiological systems consortium grant from the National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), a Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 for WJM) and pathway to independence award (DK095984 for AB) from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Herstellung der Mutter Soluble Collagen-Lösung <ol><li> Bereiten Sie oder kaufen 200 mg angesäuert, lösliche, Kollagen Typ I aus Rattenschwänzen bei 1-3 mg / 15 ml mit Standard-Isolierung-Protokolle, wie durch Piez et al. </li><li> Skalieren der Menge des Ausgangsmaterials, bezogen auf das gewünschte Endvolumen modifizierte Kollagenlösungen. Etwa machen 25-30 ml methylierter und 25-30 ml succinylierte Kollagenlösungen, die jeweils auf 3 mg / ml, 200 mg lösliches natives Kollagen. </li></ol> 2. Collagen Methylierung <ol><li> Verdünnen Sie 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Beachten Sie die Kollagenniederschlag, so dass die Lösung trüb zu werden. </li&gt; <li> Spin down das ausgefallene Kollagenlösung bei 3.000 · g für 25 min. Eine klare, gelartige Ausfällung sollte der Boden der Röhrchen sichtbar. Absaugen und entsorgen der überstehenden Flüssigkeit. </li><li> Resuspendieren fällte Kollagen in 200 ml Methanol mit 0,1 N HCl und ermöglichen dem Methylierungsreaktion unter Rühren bei RT für 4 Tage auf. Das Kollagen wird nicht auflösen, sollte aber abgesehen in sehr kleine Stücke, die sichtbar die Lösung trübe machen zu brechen. </li><li> Nach der Methylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die methylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Methanolstand. </li><li> Auflösen methyliertes Kollagen in 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 &amp; mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l in Schritten von 1 N NaOH. </li><li> Beurteilen Sie die concentration-Wert der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits Ratten Kollagen oder Hydroxyprolin-Testkit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS. </li><li> Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die methylierte Kollagen ist. </li><li> Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat. </li></ol> 3. Kollagen Succinylierung <ol><li> Verdünnen Sie die anderen 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Das Kollagen muss ausfallen, wodurch die Lösung trüb zu werden. </li><li> Man löst 40 mg succinic Anhydrid (0,4 mg pro mg Kollagen) in 10 ml Aceton (1/20 des Volumens der Kollagenlösung). Langsam (in ca. 0,5 ml-Schritten) diese Mischung zu der Kollagenlösung unter Rühren, während der pH kontinuierlich überwacht. Aufrechterhaltung des pH-Wertes über 9,0 durch Zugabe von 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH der pH-Wert 9,0 nähert. </li><li> Weiterhin Rühren bei RT 120 Minuten nach Zugabe des gesamten Bernsteinsäureanhydrid in Aceton. Beachten Sie die Lösung klar zu werden, wie die succinylierte Kollagen löst. Den pH-Wert in regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass es über 9,0 bleibt. </li><li> Einstellen des pH der Lösung auf 4,0 mit 20 ul Schritten von 1 N HCl. Beachten Sie die Lösung trüb wieder, wie die succinylierte Kollagen ausfällt. </li><li> Nach der Succinylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die succinylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Überstand mit nicht umgesetztem Bernsteinsäureanhydrid. </li><li> Man löst den succinyliert Kollagenin 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 &amp; mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l in Schritten von 1 N NaOH. </li><li> Beurteilen Sie die Konzentration der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen Collagen Ratten ELISA-Kit oder Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS. </li><li> Sterilisieren Sie die succinylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die succinylierte Kollagen ist. </li><li> Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat. </li></ol> 4. Überprüfung des Collagen Änderungen <ol><li> Bereiten Sie 1 ml-Proben von jedem der nativen, methylierte und succinylierte Kollagenlösungen und mit Wasser auf eine konzentration von 0,1 mg / mit sterilem Reinwasser für die Wasserstoffionen-Titration ml. Weitere verdünnen Puffer mindestens 1000-fach durch Dialyse gegen Wasser durch eine 10 kDa Cutoff membraneusing 3-Lösung Änderungen für jede mindestens 4 Std. </li><li> Einstellen des pH der Lösungen auf 7,3 mit kleinen Mengen von NaOH und HCl. Verwenden von pH 7,3 als eine willkürliche Referenz, führen Wasserstoffionen-Titration auf jede der Proben, wie durch Tanford 16 beschrieben, um Titrationskurven für die nativen, methylierte und succinyliert Kollagenlösungen erstellen. </li><li> Zur Erstellung der pH-Änderung pro Volumen an zugesetzter Säure gegenüber der Anzahl der gebundenen H + -Ionen pro Molekül. Der hohe pH-Wert &quot;Amino&quot; Bereich sollte eine Verschiebung in der succinylierte Kollagen in Richtung der Sternpunkt (ein Verlust von Amingruppen) zeigen, und der niedrige pH-Wert &quot;Carboxy&quot; Bereich sollte eine Linksverschiebung im methyliertes Kollagen (ein Verlust von Carboxylgruppen zeigen ) und eine Rechtsverschiebung in der succinyliertes Kollagen (eine Verstärkung in Carboxylgruppes), im Vergleich zur nativen Kollagen. </li><li> Beurteilen Sie die Wirksamkeit des Succinylierung Reaktion durch die Bestimmung der% der Aminogruppen in der nativen Kollagens durch Succinylierung ersetzt mit dem 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBA) kolorimetrisches Verfahren, nach Standardprotokollen 17,18. </li></ol> 5. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte und Zellaussaat <ol><li> Fertigen mikrofluidischen Systemen mit Standardverfahren 9. Verwenden Replik Formen von PDMS aus SU-8 Master auf Silizium unter Verwendung der Photolithographie zur mikrofluidischen Zellkulturkammern mit 100 &amp; mgr; m groß, 0,4-1,5 mm breit und 1-10 mm lange Kanäle für das Zellwachstum zu schaffen definiert. </li><li> Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Gerätes und einen Glasobjektträger zu oxidieren, und drücken Sie dann zusammen zu binden. Nach der Sterilisierung der Vorrichtung durch Exposition gegenüber UV-Licht für mindestens 30 min, Füllen der Kammer mit 50 &amp; mgr; g / ml Fibronectin in sterilem PBS und Inkubation bei 37 ° C für 45 min. </li&gt; <li> Samen der Vorrichtung mit Zellen, wie primären Ratten oder menschliche Hepatozyten, die ein Kollagen-Gel für die Stabilisierung des Phänotyps oder Differenzierungszustand erfordern. Wir verwenden 20 ul frisch isolierten primären Ratten-Hepatozyten 7,19 oder handelsübliche kryokonservierten primären humanen Hepatozyten in 14 × 10 6 Zellen / ml pro Gerät ausgesät. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 4-6 h zu befestigen, und dann waschen Sie ungebundene Zellen und ersetzen Sie die Plattenmedien mit Wachstumsmedien. Inkubieren Sie O / N, um volle Zelle sicherzustellen verbreiten und eine konfluente Monoschicht von Zellen. </li></ol> 6. Schicht-für-Schicht Kollagenablagerung <ol><li> In einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze, vorzubereiten ausreichenden Mengen methylierter und succinylierte Kollagenlösungen für 10 Anwendungen jeder Lösung pro Gerät, sowie ein paar ml Medium. Bewahren Sie die Lösung auf Eis. Wir verwenden 20 &amp; mgr; l (10-15-fache des gesamten Gerätevolumen) Kollagen pro Schicht pro Gerät. </li><li> Seinfang mit der methylierten (polykationische) Lösung, alternative Spülen der Geräte mit 20 &amp; mgr; l von methylierten und dann succinyliert Kollagenlösungen, wartet 1 Minute zwischen jeder Anwendung. Spülen Sie das Gerät insgesamt 10-mal pro Lösung, die etwa 20 Minuten dauern sollte. Arbeiten Sie schnell auf der Höhe der Zeit sind die Zellen ohne Medien minimieren. </li><li> Beobachten Kollagen langsam ansammeln am Einlass / Auslass in Abhängigkeit von seiner Größe. Wenn der Strömungswiderstand erhöht, spülen Sie das Gerät einmal oder zweimal mit Medien, und dann weiter Schichtung. </li><li> Nach der Anwendung alle Schichten, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und zum Inkubator. Je nach Zelltyp, der extrazellulären Matrix-induzierte morphologische Veränderungen, wie erhöhte Polarisation in Hepatozyten, sollte innerhalb von wenigen Stunden sichtbar. </li><li> Vorbereitung repräsentativen Vorrichtungen für die Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Standardverfahren, 9, um die Anwesenheit von einer Kollagenmatrix zu überprüfenAnordnung auf der Oberseite der kultivierten Zellen. </li></ol> 7. Die Stabilisierung der Zell-Phänotyp und Funktion <ol><li> Bild der Zellmorphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarität mit Standardmethoden für den Zelltyp. Hepatozyten, Bilder zu sammeln über 14 Tage unter Verwendung der Phasenmikroskopie lebend / tot-Färbung auf Lebensfähigkeit und CMFDA Farbstoff zur apikalen Polarisation, um die Wirkungen des Kollagenablagerung zu demonstrieren. </li><li> Für Zellmorphologie, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul PBS und Bild das Gerät unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie. </li><li> Für lebend / tot-Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul von LIVE / DEAD Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie die Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Für Gallen canaliculi Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul 2 uM CMFDA Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie das Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Sammeln der verbrauchten Medien und messen zellulären Stoffwechselprodukte zu geeigneten Zeitpunkten über die Kulturdauer, um die Zellfunktion zu bestimmen. Hepatozyten, messen die Menge von Albumin und Harnstoff in den verbrauchten Medien. </li><li> Zuführen Endpunktfunktionsanalysen auf den Zellen selbst, wie die Beurteilung Enzymaktivitätsniveaus, Antikörperfärbung oder RNA-Analyse. Für Hepatozyten, zu induzieren und zu messen Cytochrom-P450-Enzymaktivitäten oder Phase-II-Konjugation Enzym Glutathion-S-Transferase. </li></ol>

<ol>
	<li>Pedersen, J. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+in+the+third+dimension.">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li><li>Glowacki, J., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">Collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).</li><li>Vescio, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-like+drug+responses+of+human+tumors+growing+in+three-dimensional+gel-supported+primary+culture.">In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture.</a> PNAS. 84, 5029-5033 (1987).</li><li>Chandrasekaran, S., Guo, N. -. h., Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-adhesive+and+chemotactic+activities+of+thrombospondin-1+for+breast+carcinoma+cells+are+mediated+by+&#945;3&#946;1+integrin+and+regulated+by+insulin-like+growth+factor-1+and+CD98.">Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by &#945;3&#946;1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98.</a> J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).</li><li>Chen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+differentiation+of+rhesus+monkey+embryonic+stem+cells+in+three&#8208;dimensional+culture+systems.">Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three&#8208;dimensional culture systems.</a> Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).</li><li>Whelan, M. C., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+I+initiates+endothelial+cell+morphogenesis+by+inducing+actin+polymerization+through+suppression+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+A.">Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A.</a> J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).</li><li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vitro+function+of+adult+hepatocytes+in+a+collagen+sandwich+configuration.">Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration.</a> Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).</li><li>Decher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuzzy+Nanoassemblies:+Toward+Layered+Polymeric+Multicomposites.">Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites.</a> Science. 277, 1232-1237 (1997).</li><li>McCarty, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ultrathin+collagen+nanolayer+assembly+for+3-D+microtissue+engineering:+Layer-by-layer+collagen+deposition+for+long-term+stable+microfluidic+hepatocyte+culture.">A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture.</a> TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).</li><li>Swierczewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+nanoscale+elastin-like+polypeptide+polyelectrolyte+multilayers.">Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers.</a> Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).</li><li>Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+in+vitro+liver+sinusoid+mimics+using+chitosan-hyaluronic+acid+polyelectrolyte+multilayers.">The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers.</a> Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).</li><li>Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+Multicellular+Organotypic+3D+Liver+Model+with+a+Detachable,+Nanoscale+Polymeric+Space+of+Disse.">Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse.</a> Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).</li><li>Kidambi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Co&#8208;Culture+of+Primary+Hepatocytes+and+Fibroblasts+Using+Polyelectrolyte+Multilayer+Templates.">Patterned Co&#8208;Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates.</a> Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).</li><li>Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+elastin-like+polypeptide-polyelectrolyte+complexes+to+control+hepatocyte+morphology+and+function+in+vitro.">The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro.</a> Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).</li><li>Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatographic+Separation+and+Amino+Acid+Composition+of+the+Subunits+of+Several+Collagens*.">The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*.</a> Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).</li><li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hydrogen+ion+titration+curves+of+proteins.">The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins.</a> Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).</li><li>Cayot, P., Tainturier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantification+of+protein+amino+groups+by+the+trinitrobenzenesulfonic+acid+method:+a+reexamination.">The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination.</a> Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).</li><li>Kakade, M. L., Liener, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+available+lysine+in+proteins.">Determination of available lysine in proteins.</a> Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ultradünne reinem Kollagen Baugruppen auf geladenen Zellen oder Materialoberflächen mit Layer-by-Layer Deposition von modifizierten Kollagene hinterlegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Methylierung und Succinylierung von nativem Kollagen polykationische und polyanionische Kollagenlösungen (Abbildung 1), die mit der Schicht-für-Schicht-Technik verwendet werden kann, um ultradünne Kollagenmatrix Anordnungen an Zellen (2) zu hinterlegen oder andere geladene erstellen Materialoberflächen. Solche ultradünnen Matrixschichten die Morphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarisation von Zellen wie Hepatozyten (Figur 3), nach dem Aussäen in Mikrofluidik-Vorrichtungen als auch ihre Funktion (Figur 4) zu stabilisieren. Für eine erfolgreiche Abscheidung von ultradünnen Kollagenschichten, die Modifikationsreaktionen Schaffung der methylierte und succinylierte Kollagene sind kritisch. Weil die Carboxylgruppe Methylierungsreaktion nicht günstig ist, dasKollagen Methylierungsreaktion muss in angesäuertem Methanol durchgeführt werden, um die Reaktion nach vorn, basierend auf Prinzip von Le Chatelier fahren. Daher ist es wichtig, alle überschüssige Wasser aus dem Kollagen nach der pH-Ausfällung vor der Auflösung des präzipitierten Kollagen in angesäuertem Methanol, um die Reaktionseffizienz zu erhöhen, zu entfernen. Für die Succinylierung Reaktion, wobei der pH-Wert der Lösung oberhalb von 9 während der Zugabe des Bernsteinsäureanhydrids in Aceton ist kritisch. Kontinuierliche Überwachung des pH-Werts und die langsame Zugabe des Bernsteinsäureanhydrids Acetonlösung sind hilfreich für die Gewährleistung einer effizienten Reaktion. Während des Schicht-für-Schicht-Abscheidungs, ist es wichtig, die Zeit, die die Zellen gehen ohne Medien minimieren. Das Verfahren für die 10 Doppelschichten dauert etwa 20 min, die etwa so lang wie die meisten Zellen sollten ohne Medien außerhalb des Inkubators sein soll. Wenn mehr als 10 Doppelschichten abgeschieden werden muss, ruhen die Zellen in Medien in einem Inkubator für 3-4 Stunden zwischen Collagen Abscheidungen, um die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten. Am anderen Extrem wird zu wenige Schichten nicht wirksam bei der Aufrechterhaltung der Zellmorphologie. Bei unseren Tests haben 3 Schichten nicht pflegen Zellmorphologie, während 10 Schichten hat. Verschiedene Modifikationen an den Verfahren vorgenommen werden, um Probleme zu beheben. Die Zeit und die Temperatur der Methylierungsreaktion kann variiert werden, wenn Probleme auftreten. Beispielsweise die Verringerung der Reaktionstemperatur auf 4 ° C und erhöht die Zeit bis 7 Tagen können die Effizienz zu erhöhen. Auch in Abhängigkeit von dem Ausmaß der Polymerisation während der pH-Extraktion, das Kollagen manchmal vollständig in der angesäuerten Methanol auflösen während der Methylierungsreaktion. Wenn dies auftritt, mit 10 M NaOH, um den pH auf 9-10 zu bringen, nachdem die Reaktion, um das Collagen auszufällen, so dass es während des nächsten Schrittes kann pelletiert werden abgeschlossen. Während der Anwendung der Schicht-für-Schicht-Abscheidungs ​​in mikrofluidischen Vorrichtungen können kleine Kanäle oder Ports cl werdenogged mit Kollagen, durch einen Anstieg in dem Gerät Strömungswiderstand angegeben. Spülen Sie das Gerät mit frischen Medien sollten keine Blockaden zu entfernen, so dass Abscheidung, um fortzufahren. Das manuelle Aufbringen der Schicht-für-Schicht Kollagen, wie hier beschrieben ist eine Einschränkung in Bezug auf die Skalierung und Automatisierung der Mikrofluidik-Vorrichtungen. Jedoch ist diese Technik mit Standard-Mikrofluid-Hardware, einschließlich Ventilen und Pumpen, die verwendet werden könnten, um das Verfahren zu automatisieren und bereiten Anordnungen von Geräten gleichzeitig kompatibel. Eine weitere Einschränkung dieser Technik für die Verwendung in Plattenkultur ist, dass es eine relativ große Menge von nativem Kollagen erfordert. Mikrofluidik-Anwendung können die Volumina von methylierten und succinyliertes Kollagen verwendet werden, um ultradünne Kollagenschichten in vielen Geräten zu schaffen. Mit Standard-Gewebekulturplatte, auf der anderen Seite, die zur Beschichtung von Brunnen erforderlichen Volumina geworden prohibitive mit zunehmender Größe auch. Diese Schicht-by-layer-Technik für die Abscheidung von ultradünnen Kollagenmatrixschichten könnten durch den Einsatz alternativer und Funktionsänderungen sowie durch die Schaffung von mehreren Schichten von Zellen, die durch den dünnen Matrixanordnungen getrennt entwickelt werden. Obwohl die relativ einfache Aminosäureseitenkettenmodifikation Reaktionen der Methylierung und Succinylierung wurden hier verwendet, könnten alternative oder zusätzliche Reaktionen statt, um funktionalisierte Kollagene angelegt werden. Die funktionalisierten Seitenketten sollte noch ergeben Proteine ​​mit Netto-Gesamt positiven und negativen Ladungen, aber solche Funktionalisierung kann für eine Vielzahl von Anwendungen.

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult. 
One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.1 Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.2 Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells3,45, microvascular endothelial cells6, and hepatocytes7, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.
To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique8 with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.9
Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes10 to cover hepatocytes in plate culture11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

<table><tbody><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>R%D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>succinic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>succinylation reagent</td></tr><tr><td>anhydrous methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>methylation reagent</td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>rat collagen type I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>option for detecting collagen content</td></tr></tbody></table>

layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Natives Kollagen kann durch Methylierung und Succinylierung an polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zur Verwendung in Schicht-für-Schicht-Abscheidungs ​​schaffen modifiziert werden. Succinylierung modifiziert die ε-Aminogruppen des nativen Kollagens mit Succinylgruppen und Methylierung modifiziert die Carboxylgruppen des nativen Kollagens mit einer Methylgruppe (1A). Diese Modifikationen der Kollagen-Protein Aminosäure-Seitenketten verändern die pH-Titrationskurven für die Lösungen. Succinylierung reduziert die Anzahl der Aminogruppen und erhöht die Anzahl der Carboxylgruppen, während Methylierung hat keine Auswirkung auf den Aminogruppen und reduziert die Anzahl der Carboxylgruppen, im Vergleich zu nativem Kollagen (1B). Diese Modifikationen verändern die Ladungseigenschaften der Kollagenmoleküle. Succinylierung entfernt positiv geladenen Gruppen und ersetzt sie durch die negativ geladene Gruppen und Methylierung entfernt negativ geladenen Gruppen (1C &lt;/ strong&gt;). Schicht-für-Schicht-Abscheidungs ​​der methylierten und succinylierte Kollagenlösungen (COL LBL) erzeugt ein ultradünner Kollagenmatrixanordnung auf der Oberseite der geladenen Oberflächen, wie beispielsweise Zellen (2A). Primären Hepatozyten auf Fibronectin-beschichtete Glas innerhalb einer Mikrofluidik-Vorrichtung (2B) ausgesät kann mit einer solchen rein Kollagenmatrix Anordnung (2C) beschichtet werden. Ablagerung von 10 Doppelschichten auf Zellen schafft eine Kollagenschichtdicke von etwa 140 nm (Figur 2D). Die ultradünne Kollagenaufbau Schicht unter Verwendung der COL LBL-Technik abgeschieden stabilisiert primären Hepatozyten für mehr als 14 Tage im mikrofluidischen Bauteilen. Hepatozyten ohne eine obere Abdeckung Matrix verlieren ihren differenzierten Phänotyp, Vertrag, und heben Sie die Oberfläche des Mikrofluidvorrichtungen mit der Zeit (Fig. 3A-C). Im Gegensatz dazu Hepatozyten mit einer ultradünnen Kollagen Montage der Wartung des abgedecktn ihre differenzierte Morphologie und Polarisation über 14 Tage (Abbildung 3D-F). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bei mehr als 90% (Figur 3G-I) erhalten. Darüber hinaus ist die Polarisation der mit COL LBL behandelten Hepatozyten erhöht über die Zeit und zeigt die Entwicklung von einem apikalen Gallen canalicular Netzwerk (3J-L). Neben der Zelllebensfähigkeit, Morphologie und Polarisation, erholt sich der COL LBL-Technik und stabilisiert die Funktion der primären Hepatozyten auf einem Niveau ähnlich dem Standardverfahren für Zellen in Platten. Die Sekretion von Albumin durch Hepatozyten niedrig ist unmittelbar nach dem Beschichten, und nach wie vor gering, es sei denn die Zellen veranlasst, durch eine Matrix Belag polarisieren. Nach COL LBL Behandlung der Albumin-Sekretion durch die Hepatozyten über 8-10 Tage ansteigt bevor sie sich stabilisiert (4A). Harnstoffproduktion hoch ist unmittelbar nach Zellaussaat und nimmt mit der Zeit in den Zellen not mit einer Matrix bedeckt, stabilisiert Harnstoffherstellung nach 8-10 Tagen in Hepatozyten mit COL LBL (4B) stabilisiert. Cytochrom P450 (CYP) Enzyme-Expression in Reaktion auf Reize ist eine spezialisierte Funktion von Hepatozyten. Die Induktion von CYP1A1 in Hepatocyten in Abhängigkeit von 3-Methylcholanthren wurde gewonnen und bis zu 14 Tage nach der Behandlung COL LBL (4C) stabilisiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig1.jpg" /> Abbildung 1. Rattenschwanz Kollagen Lösungen wurden chemisch modifiziert, um Netto-positiv zu erstellen oder net negativ geladenen Polymerlösungen. (A) Schematische Darstellungen der Succinylierung und Methylierungsreaktionen, die Carboxyl- und ε-Aminogruppen zu modifizieren sind. (B) Wasserstoff Titrationskurve Derivate zeigen Veränderungen in der relativen Anzahl von H + Ionen benötigt wird, um den Lösungs-pH nach col verändernlagen Modifikation. (C) Die Nettoaufwendungen (Mittelwert ± SD) der von der H + Verschiebungen berechnet modifizierten Kollagenlösungen (B) normiert auf nativen Kollagens. MC: methylierte Kollagen. SC: succinyliert Kollagen. AA: Aminosäurereste. Re-print mit Genehmigung aus 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schicht-für-Schicht-Abscheidung von modifizierten Kollagenlösungen erzeugt einen ultradünnen Kollagenmatrixanordnung auf der Oberseite der Hepatozyten. (A) Schematische Darstellung der Hepatocyten ausgesät Fibronektin auf einer Mikrovorrichtung und mit abwechselnden methylierte und succinylierte Kollagenlösungen inkubiert. TEM-Querschnitte der repräsentativen (20 Zellen pro Gruppe untersucht) conSteuerung (B) und COL LBL behandelten (C) Hepatozyten nach 2 Tagen Kultur. Arrows: LBL Kollagenschicht. Maßstab:. 2 um (D) COL LBL Schichtdicke (Mittelwert ± SD) pro Zelle von TEM-Aufnahmen (n = 20 Zellen von 4 Geräte) gemessen. Geändert von 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die COL LBL-Technik gehalten Hepatozyten-Morphologie, die Lebensfähigkeit und Polarisierung in Kleinstgeräten mehr als 14 Tagen in Kultur. Hepatozyten ohne obere Schicht in Mikrovorrichtungen (Negativkontrolle) Vertrag und heben Sie die Oberfläche im Laufe der Zeit (A-C). LBL Ablagerung von modifizierten Kollagene hält Hepatozyten-Morphologie (D-F) und VIABility (G-I) in Kleinstgeräten über 14 Tage. CMFDA ist ein generischer Zellmarker, die im Cytoplasma von nichtpolarisierten Hepatozyten (J) verbleibt. Im Laufe der Zeit kann die Entwicklung von Gallenkanälchen durch Ausscheidung des Fluorophors in canalicular Räume (K), die um die Zellen entwickeln sich im Laufe der Zeit (L) gesehen werden. Bildmaßstabsbalken: 100 &amp; mgr; m. Inset Maßstab: 50 &amp; mgr; m. Geändert von 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig4.jpg" /> Abbildung 4. COL LBL stabilisiert Hepatozyten-Albumin und Harnstoff Schnitte und CYP-Aktivität über 14 Tage in mikrofluidischen Systemen. (A) Albumin-Sekretion von Hepatozyten in COL LBL begann niedrig und erhöht sich mit der Zeit until erreichte ein Plateau bei Tag 10 (B) Harnstoff-Sekretion von COL LBL Hepatozyten nahm mit der Zeit bis zum Erreichen einer Hochebene am Tag 10 (C) die Induktion von CYP1A Aktivität niedrig war am Tag 2, aber deutlich am Tag 7 erhöht wird, ein Ebene, die durch Tag 14 Mittelwert ± SEM wurde beibehalten; COL LBL: Hepatozyten nach LBL Kollagenablagerung kultiviert; NoTop: Hepatozyten ohne oberen Matrix-Schicht kultiviert; n = 6-8 Geräte. Geändert von 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization at JoVE.com

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Serie: Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Forschung

Biotechnik

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...