Die Autoren erkennen des National Cancer Institute von der nationalen Institute der Gesundheit Weg zur Unabhängigkeit Award (K99CA201603).

Der neonatalen Ratte Herzzellen in diesem Protokoll verwendeten wurden isoliert von 2 Tage alten Sprague-Dawley Ratten nach einem etablierten Verfahren56 durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Brigham and Women es Hospital genehmigt.
1. Instrumente der Bioprinter
<ol>
	<li>Legen Sie eine kleinere stumpfe Nadel (z.B., 27 G, 1 Zoll) als Kern in der Mitte einer größeren stumpfen Nadel (z.B., 18 G, ½ Zoll) als die Hülle, die Dual-Layer-, konzentrische mikrofluidischen Druckkopf zu konstruieren; Stellen Sie sicher, dass die Kern-Nadel leicht hervorstehenden ist (~ 1 mm) länger als die äußere Hülle (Abb. 1A). Die Ausrichtung ist in der Regel manuell eingestellt, aber können wenn notwendig Abstandhalter der richtige Größen zeitlich zwischen der inneren/äußeren Nadeln auf die Spitze und die Lauf-Seiten gerne konzentrische Ausrichtung eingeklemmt werden. Versiegeln der Kreuzung der Fässer mit Epoxy-Kleber und die Ausrichtung Abstandhalter aus der Spitze Seite ggf. entfernen.</li>
	<li>Setzen Sie eine andere Nadel (23G) in den Lauf der zentralen Nadel in umgekehrter Richtung.  Dann erzeugen ein Loch seitlich auf dem Lauf der äußere Nadel und legen Sie einen Metallstecker der passenden Größe in das Loch, gefolgt von Versiegelung mit Epoxy-Kleber.</li>
	<li>Verbinden Sie die Eingänge des Druckkopfes auf eine Zweikanal-Spritzenpumpe für die Injektion der Bioink und der Vernetzung-Lösung individuell, durch zwei PVC-Rohre. Montieren Sie den Extruder auf den Kopf des einen Bioprinter mit einer Kunststoff-Halter von Poly(methyl methacrylate) (PMMA) gemacht. Hinweis: Bioprinter Auswahl richtet sich nach Verfügbarkeit. In unserem Fall haben wir dieses Setup auf mehreren im Handel erhältlichen Bioprinters erfolgreich getestet. Jedoch sollte jede Bioprinter, die einem X-y-Z motorisierten Stadium verfügt über im Prinzip Integration von diesem mikrofluidischen Druckkopf machen.</li>
</ol>
(2) Bioprinting Microfibrous vaskulären Bettes
<ol>
	<li>Machen die Bioink mit einer Mischung aus Alginat (4 w/v%, niedrige Viskosität), Gelatine Methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58und Photoinitiator Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) aufgelöst in 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) Piperazin-1-Yl] Ethan Sulfonsäure (HEPES-Puffer, pH 7.4) mit 10 vol.% fetalen bovine Serum (FBS).</li>
	<li>Machen Sie eine Lösung von 0,3 M CaCl2 in HEPES-Puffer mit 10 vol.% FBS als Trägerflüssigkeit Vernetzung.</li>
	<li>Unmittelbar vor Bioprinting menschliche Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) aus den Kolben mit Behandlung von 0,05 w/v% Trypsin für ca. 5-10 min zu distanzieren und Aufschwemmen der Zellen in der Bioink in einer Konzentration von 5-10 × 106 Zellen/mL. Pipette die Suspension langsam 5 bis 10 Mal um homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Starten Sie die Injektion von Bioink/Vernetzung Flüssigkeit mit einem Zweikanal-Spritzenpumpe an die gleiche Volumenströme von 5 µL/mL. Die Ströme können dürfen kontinuierlich für bis zu 1 min laufen lassen, bis sie stabilisieren. Anschließend starten Sie die Bewegung des Druckkopfes durch die Kontrolle der Bioprinter Abscheidung Geschwindigkeiten von ca. 4 mm/s (Abbildung 1B). Diese Geschwindigkeiten können feine müssen tuning mit jeder neuen Setup, um optimale Bioprinting zu gewährleisten. Der Bioprinting-Prozess erfolgt in der Regel bei Raumtemperatur (21-25 ° C), aber diese Temperatur kann verändert werden. Der Bioprinting Prozess sollte schnell Ionischen Gelierung der Alginat-Komponente und Ablagerung von ein Microfibrous Gerüst (Abbildung 1B) ermöglichen.</li>
	<li>Nachdem das Gerüst Bioprinted ist, erreichen Sie chemische Gelierung durch weitere Photocrosslinking der GelMA Komponente, auf etwa 5 bis 10 mW/cm2 von UV-Licht (360-480 nm) für 20-30 s (Abbildung 1C).</li>
	<li>Spülen Sie nach der Bioprinting und Vernetzung sanft das Gerüst mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die überschüssige CaCl2zu entfernen. Kultur das Mediumwechsel beladenen Microfibrous Gerüst in Endothelzellen Wachstumsmedium (EGM) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 vol.% CO2 für bis zu um 16 Tage mit Medium verändert mindestens alle 2 Tage. Überwachen Sie die Morphologien Mediumwechsel unter dem Mikroskop während der Kulturdauer.</li>
</ol>
3. bauen die vaskularisierte Gewebe
<ol>
	<li>Sobald die Mediumwechsel auf den Peripherien von Mikrofasern in das Gerüst, um die Lumen-ähnliche Strukturen (Abbildung 1-D) bilden migriert haben, rufen Sie das Gerüst und legen Sie sie vorsichtig auf die Oberfläche einer hydrophoben Oberfläche (z.B. eine Platte aus Polymethylsiloxane [PDMS]). Verwenden Sie ein Stück des sterilen Filterpapiers, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem interstitiellen Raum des Gerüstes mit Kapillare Kraft.</li>
	<li>Sofort Tropfen Sie einen (ca. 20-40 µL) Aussetzung der sekundären Zelltyp (z.B. Herzzellen) im Medium bei einer Dichte von 1-10 × 106 Zellen/mL auf das Gerüst, das die gesamte Zwischenraum des Gerüstes (Abbildung 1E) infiltrieren sollte. Inkubieren Sie eine solche Konfiguration in einem Inkubator (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95 % Relative Luftfeuchtigkeit) für 0,5 - 2 h damit die Zellen auf die einzelnen Mikrofasern halten. Überwachen Sie die Tropfengröße im Zeitraum um sicherzustellen, dass keine spürbaren Verdunstung beobachtet wird.</li>
	<li>Vorsichtig Waschen der Gerüste durch Schütteln in einem PBS-Bad, nicht-anhaftende Zellen und Kultur das Konstrukt im jeweiligen Medium zu entfernen, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet wird.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Bau der co-axial Druckkopf ist einen entscheidender Schritt in Richtung erfolgreiche mikrofluidische Bioprinting, um gleichzeitige Lieferung sowohl die Bioink aus dem Kern und der Vernetzungsmittel aus der Scheide zu ermöglichen. Während in diesem Protokoll mit einer 27G Nadel als Kern und einer 18G-Nadel als Shell ein Beispiel Druckkopf erstellt wurde, kann es leicht zu einer Vielzahl von Kombinationen mit verschiedenen Größen der Nadeln verlängert werden. Die Veränderung in der Nadel-Größen, die Ergebnisse in die Veränderung der Strömung in den einzelnen Phasen geliefert, benötigen jedoch weitere Optimierung der Durchflussmengen sowohl die Bioink der Vernetzungsmittel (individuell einstellbar mit zwei Spritzenpumpen statt eines Zweikanal-) und möglicherweise auch die Ablagerung Geschwindigkeit durch die Bioprinter entstehen.
Die Kombination der Parameter (Nadeldicken, Durchflussmengen und Ablagerung Geschwindigkeit) in das aktuelle Protokoll führte zu die Bioprinted Mikrofasern mit einem Durchmesser von etwa 120 µm unmittelbar nach der Ablagerung, die bis etwa 150 µm nach Gleichgewichtherstellung im mittleren55anschwollen. Dieser Größe entspricht auch etwa die Schichtdicke der Bioprinted Konstrukte, da gab es keinen Raum zwischen den Schichten die Mikrofasern. Der Durchmesser des Bioprinted Mikrofasern ist eine Funktion von allen drei Parameter54,63; die Größe der Kern Nadel des Druckkopfes und der Volumenstrom des Bioink sind positiv korreliert mit dem Durchmesser von Mikrofasern, während die Größe der Scheide Nadel, die Durchflussmenge der Vernetzungsmittel und die Ablagerung Geschwindigkeit sind negativ korreliert mit dem Durchmesser der Mikrofasern. Ablagerung von Microfibrous Gerüste von beliebigen Strukturen54,55würde die Kontrolle über die Bewegung der Druckkopf und/oder der motorisierten Bühne ermöglichen.
Darüber hinaus kann die Formulierung der Bioink das Profil der Bioprinting auch ändern. Zum Beispiel die Menge an Alginat und GelMA kann je nach spezifischen Anwendungen leicht moduliert werden, und es ist möglich, zusätzliche Materialien verschmelzen die Bioink, wie z. B. Polyethylenglykol-Tetraacrylate (PEGTA), die die Mechanik der Bioprinted Mikrofasern40erhöht. Die UV-Vernetzung bestimmt auch die mechanischen Eigenschaften von der Mitte des Bioprinted Mikrofasern, die das Verhalten der eingebetteten Endothelzellen54weiter beeinflussen können. Die Parameter, die in diesem Protokoll berichtet auf Mediumwechsel optimiert wurde. Allerdings wird davon ausgegangen, dass für jede andere Art von Endothelzellen die Vernetzung-Parameter neu optimierte Lumen Bildung in die Mikrofasern zu erreichen sein müssen.
Um eine sekundäre Zelle Art auf dem Bioprinted Kreislauf Bett Samen, ist es notwendig, das Gerüst auf ein Stück der hydrophoben Oberfläche legen und sicherstellen, dass die meisten Mittel in den interstitiellen Raum des Gerüsts entfernt ist. Dies ermöglicht sofortige Infiltration der Zellsuspension in die Microfibrous Struktur mit den Tröpfchen freistehende und Verkapselung das Gerüst im Laufe der Aussaat, Maximierung der Anzahl der Zellen auf der Oberfläche der Mikrofasern. Obwohl eine relativ hohe Dichte von Herzmuskelzellen bei 5 × 106 Zellen/mL für den Bau von Herzmuskelgewebe in das aktuelle Protokoll verwendet wurde, kann so Dichte willkürlich abgestimmt werden, um spezifische Gewebetypen zu entsprechen. Es ist auch wichtig, eine feuchte Umgebung beizubehalten, die realisiert werden kann, durch das Ausfüllen von sterilen Wassers oder PBS in der Nähe von dem Gerüst (d. h. in die umliegenden Brunnen oder der Raum umgibt die PDMS-Platte), um sicherzustellen, dass die geringe Menge des Mediums für die Aussaat im Zeitraum der Aussaat nicht verdunstet.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir ein detailliertes Protokoll der mikrofluidischen Bioprinting für bequeme Herstellung von vaskularisierte Gewebe bereitgestellt. Bei dieser Strategie wird ein Kern-Mantel-co-axial-Druckkopf verwendet, um gleichzeitige Extrusion von einem Hybrid-Bioink vom Kern und Vernetzung-Agent aus der Scheide zu ermöglichen. Auf Co-Extrusion die Bioink sofort erfährt physikalische Vernetzung für die Alginat-Komponente bildet eine geschichtete Microfibrous Gerüst, wie durch die Bewegung der Bioprinter programmiert, während das gesamte Konstrukt ist weiter chemisch Photocrosslinked für die GelMA Komponente um langfristige Stabilität zu ermöglichen. Endothelzellen, die während des Bioprinting Prozesses in die Mikrofasern gekapselt können vermehren und migrieren zu den Peripherien vorausgesetzt Lumen-ähnliche Strukturen, das Gerüst in einem Kreislauf Bett verwandeln. Durch impfen eine sekundäre Zelle Art, kann ein Konstrukt vaskularisierte Gewebe anschließend generiert werden. Diese mikrofluidische Bioprinting Strategie ist einzigartig und kann auf eine Vielzahl von Gewebearten wie Leber, skelettartigen Muskel bequem verlängert werden, und Krebserkrankungen neben der Herzmuskel in das aktuelle Protokoll, durch rationale Kombination der gewünschten Zelle Arten dargestellt und speziell Muster Bioprinted Microfibrous Gerüste. Die vaskularisierte Gewebe Konstrukte, die mit einem solchen Verfahren können für Geweberegeneration in Vivo oder in Vitro Gewebe Modellierung verwendet werden.
Es gibt mehrere Einschränkungen verbunden mit der in diesem Protokoll beschriebenen mikrofluidische Bioprinting-Strategie. Erstens ist der Durchmesser des Bioprinted Mikrofasern beschränkt sich auf wenige hundert Mikrometer durch die Diffusionsbarriere der Hydrogelmatrix für das CaCl2 Lösung effizient vernetzen die Alginat-Komponente im Kern. Übermäßig niedrige physische Vernetzung Dichte würde den mehrschichtigen Aufbau instabil machen. Zweitens kann die physische Vernetzungsmittel CaCl2 -Lösung negativ auf bestimmte Endothelzellen auszuüben, die empfindlicher als Mediumwechsel, wie z. B. die endotheliale Vorläuferzellen sind. Die Machbarkeit der Verwendung solch einer Bioprinting-Methode für eine breitere Palette von Endothelzellen Typen erfordern weitere Untersuchungen. Drittens, während der endothelialen Zellen Lumen-artige Strukturen innerhalb der Mikrofasern bilden können, sind die Kerne dieser Mikrofasern nicht hohl Perfusion zu ermöglichen. Daher sind Nährstoffe und Sauerstoff noch vor allem durch den interstitiellen Raum in der Bioprinted-Gerüste zur Verfügung gestellt. Die Anpassung der Opfer Materialien als Photocrosslinkable Komponente des Bioink64 kann dieses Problem in zukünftigen Versionen der Technologie lösen. Alternativ baut Bioprinted hohlen Microfibrous Strukturen42,43,65,66,67,68 als vaskuläre Bett verwendet werden können, um direkte Perfusion der vaskularisierte Gewebe zu gewährleisten. Schließlich kann Bioprinting klinische mittlere Gewebe noch schwierig sein, kann wahrscheinlich angesprochen werden durch die Integration von Design der angeordneten mikrofluidischen Druckköpfe69 erweitert-Skala Bioprinting bei hohem Durchsatz zu erreichen.

Tissue engineering Ziele Funktionsgewebe Ersatzstoffe zu generieren, die verwendet werden können, um zu ersetzen, wiederherstellen oder ergänzen diese verletzten oder erkrankten in den menschlichen Körper1,2,3,4, oft durch eine Kombination der gewünschten Zelltypen, bioaktive Moleküle5,6und Biomaterialien7,8,9,10. Vor kurzem haben Gewebe-engineering-Technologien auch zunehmend angenommen, um in-vitro- Gewebe und Organ Modelle generieren, die wichtigen Funktionen von ihren Kollegen in Vivo für Anwendungen wie die Medikamentenentwicklung, Ersatz von konventionellen vereinfachenden planar Zelle Kulturen11,12,13,14,15,16,17,18,19zu imitieren. In beiden Situationen die Fähigkeit, komplexe Mikroarchitektur und hierarchische Struktur der menschlichen Gewebe rekapitulieren ist entscheidend in die Lage versetzen Funktionalität der technischen Gewebe10, und Möglichkeiten, um den technischen Geweben eine vaskuläre Netzwerk integrieren sind insbesondere der Nachfrage da Vaskularisierung eine der größten Herausforderungen auf dem Feld20,21,22,23 stellt.
Bis heute eine Vielzahl von Ansätzen wurden entwickelt in diesem Zusammenhang in einem Versuch, Blutgefäß Strukturen in veränderter Gewebe Konstrukte mit unterschiedlichem Erfolg8zu bauen. Beispielsweise können Selbstmontage von Endothelzellen zur Erzeugung von mikrovaskulären Netze24; Lieferung von angiogene Wachstumsfaktoren induziert nachhaltige Neovaskularisation25,26; Verwenden von vaskulären Vorläuferzellen und Perizyten erleichtert endothelial Zelle Wachstum und Montage24,27; Gestaltung von Gerüst Eigenschaften ermöglicht präzise Modulation der Vaskularisierung28,29; und Blatt-Zelltechnologie ermöglicht die bequeme Manipulation von vaskulären Schichtung30. Dennoch diese Strategien nicht die Fähigkeit zur Steuerung der räumlichen Strukturierung des Gefäßsystems, führt häufig zu zufälligen Verteilung der Blutgefäße innerhalb ein veränderter Gewebe Konstrukt und damit begrenzte Reproduzierbarkeit verleihen. In den letzten Jahren hat eine Klasse von Basistechnologien zur Lösung so eine Herausforderung, durch ihre unvergleichliche Vielseitigkeit der Hinterlegung komplexe Gewebe Muster am High Fidelity und Reproduzierbarkeit in eine automatisierte oder halbautomatisierte Weise31,32,33Bioprinting entwickelt. Opfer Bioprinting34,35,36,37,38, eingebettete Bioprinting39,40,41und hohlen Struktur Bioprinting/Biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 haben alle bewiesen die Machbarkeit Gefäß- oder vaskularisierte Gewebe zu erzeugen.
Alternativ eine mikrofluidischen Bioprinting Strategie, Microfibrous Gerüste zu fabrizieren vor kurzem entwickelt worden, wo ein Hybrid-Bioink bestehend aus Alginat und Gelatine Methacryloyl (GelMA) wurde durch den Kern einer konzentrischen Druckkopf und einen Kalzium-Chlorid (CaCl2) Lösung geliefert erfolgte durch den Außenmantel Fluss der Druckkopf54,55. Die Co-Extrusion der zwei Ströme durfte für sofortige physikalische Vernetzung der Alginat Komponente Mikrofaser Bildung zu ermöglichen, während spätere Photocrosslinking dauerhafte Stabilisierung der mehrschichtigen Microfibrous Gerüst gewährleistet. Der Hinweis fanden sich Endothelzellen gekapselt innerhalb der Bioprinted-Mikrofasern zu vermehren und migrieren zu den Peripherien der Mikrofasern vorausgesetzt Lumen-ähnliche Strukturen, die die vaskuläre Bett54,55nachgeahmt. Diese Bioprinted endothelialized vaskuläre Betten konnte anschließend gefüllt mit gewünschten weiterführenden Zelltypen, vaskularisierte Gewebe55weiter zu bauen. Dieses Protokoll bietet somit ein detailliertes Verfahren einer solchen mikrofluidische Bioprinting Strategie durch die konzentrische Düse Design, sorgt für bequeme Herstellung von vaskularisierte Gewebe für potenzielle Anwendungen in der Gewebetechnik und organoide Modellierung ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>Alginic acid sodium salt from brown algae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0682</td><td>BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder</td></tr><tr><td>Gelatin type A from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>Gel strength 300</td></tr><tr><td>Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4&#039;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td>98%</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td>Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>BioXtra, &amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001</td><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)</td></tr><tr><td>GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td>GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)</td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12430054</td><td>High glucose, HEPES</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Clear 0.5 kg Kit</td></tr><tr><td>UV curing lamp system</td><td>Excelitas Technologies</td><td>OmniCure S2000</td><td>Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor</td></tr></tbody></table>

microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids

Vaskularisierte Gewebe-Engineering konstruiert und Organellen wurde historisch schwierig. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode basiert auf mikrofluidische Bioprinting um ein Gerüst mit mehrschichtigen interlacing Hydrogel Mikrofasern zu generieren. Um glatt zu erreichen war Bioprinting, ein Kern-Mantel mikrofluidischen Druckkopf enthält eine zusammengesetzte Bioink Formulierung aus den Kernfluss und die Vernetzung Lösung durchgeführt durch die Scheide-Fluss, extrudiert entworfen und auf die Bioprinter ausgestattet. Durch das Mischen Gelatine Methacryloyl (GelMA) mit Alginat, ein Polysaccharid, das momentane ionische Vernetzung in Anwesenheit von erfährt wählen Sie zweiwertige Ionen, gefolgt von einer sekundären Photocrosslinking der GelMA Komponente zur dauerhaften Stabilisierung zu erreichen, ein Microfibrous Gerüst konnte mit dieser Strategie der Bioprinting abgerufen werden. Wichtig ist, können die Endothelzellen gekapselt im Inneren der Bioprinted Mikrofasern die Lumen-ähnliche Strukturen wie das Gefäßsystem im Laufe der Kultur für 16 Tage bilden. Das endothelialized Microfibrous Gerüst kann als vaskuläre Bett weiterverwendet werden, um eine vaskularisierte Gewebe durch anschließende Aussaat des sekundären Zelltyps in den interstitiellen Raum der die Mikrofasern zu konstruieren. Mikrofluidische Bioprinting bietet eine allgemeine Strategie bequem Engineering vaskularisierte Gewebe bei High Fidelity.

Mikrofluidische Bioprinting Strategie ermöglicht Direktextrusion Bioprinting Microfibrous Gerüste mit dünnflüssigen Bioinks54,55. Wie in Abbildung 2A, ein Gerüst mit einer Größe von 6 × 6 × 6 mm mit3 &#62; 30 Schichten aus Mikrofasern Bioprinted innerhalb von 10 min werden könnte. Die sofortige ionische Vernetzung der Alginat-Komponente mit CaCl2 erlaubt für hervorragende Standsicherheit während des Bioprinting Prozesses während der nachfolgenden physischen Photocrosslinking der GelMA Komponente gewährleistet langfristigen Stabilität des Gerüstes Bioprinted Microfibrous, wie in Draufsicht und Seitenansicht gezeigt in den Figuren 2 b und 2 Cangegeben. Die Mikrofasern erreicht in diesem Fall den Bioprinting Bedingungen in das Protokoll angegeben wurden ca. 100-150 µm im Durchmesser, die leicht Anstieg Überstunden mit Schwellung würde.
Bioprinting Prozesses, einschließlich der mikrofluidischen Extrusion von der Bioink, die ionische Vernetzung und die Photocrosslinking hatten nicht wesentlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der gekapselten Mediumwechsel. Die Zellen konnte halten eine relativ hohe Tragfähigkeit des &#62; 80 % nach Abschluss all dieser Verfahren (Abb. 2D). Wie berichtet früher54,55könnte die Mediumwechsel allmählich vermehren und migrieren in die Mikrofasern aus der anfänglich zufällige Verteilung am Tag 0 (Abb. 2E) an den Peripherien der Mikrofasern, Lumen-ähnliche Strukturen am Tag 16 Post-Bioprinting in der Kultur (Abbildung 2F) zu übernehmen. Solches Verhalten für die Mediumwechsel beobachtet wurde wahrscheinlich durch die innere Schnittstelle-gesteuerte Tendenz der Endothelzellen sowie die höhere Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff, die rund um die Mikrofasern als ihre Innenräume55,59.
Das Microfibrous Gerüst kann auch als eine eigenständige Plattform für das Tissue Engineering fungieren. Beispiel von Herzmuskel-Gewebe, waren neonatalen Ratte Kardiomyozyten auf den interstitiellen Raum leski Bioprinted bei einer Dichte von 5 × 106 Zellen/mL entkernt und kultiviert in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 vol.% FBS ergänzt. Das Medium wurde jeden Tag in den ersten 2-3 Tagen bis die Kardiomyozyten fingen, nach denen ausgetauscht nur ½ war Medium alle 2-3 Tage55,60,61,62geändert. Die Zellen konnten ihre spontane und synchronisierte schlagen für bis zu 9-28 Tage je nach Zelle Quelle und Konfiguration der Gerüste55pflegen. Die Reife Kardiomyozyten auf dem Schafott zeigte auch starken Ausdruck funktionelle kardiale Biomarker wie in die konfokale Fluoreszenzbilder dargestellt in Abbildung 3, einschließlich zugeschrieben α-Actinin (Abb. 3B) und Connexin-43 (Abb. 3C).
Kombination der Endothelzellen und der sekundären Zelltyp, konnte eine vaskularisierte Gewebe weiter konstruiert werden. Wiederum wurden mit Myokard als Vorbild, nach das vaskuläre Bett in einem Bioprinted Microfibrous Gerüst nach etwa 16 Tagen Kultur gebildet hat, neonatalen Ratte Kardiomyozyten anschließend in den interstitiellen Raum des Gerüstes ausgesät. Nach Kultivierung und Reifung in ein gemeinsames Medium der 1:1-Volume Ration der EGM:DMDM besteht, könnte eine endothelialized Herzmuskelgewebe ausstellenden spontan und synchron schlagen55gebildet werden. Single-Flugzeug konfokale Fluoreszenzbilder in Abbildung 4 weiter offenbart Koexistenz von Zelltypen, die mit der Mediumwechsel hauptsächlich vorhanden in den Grenzen von Mikrofasern (Abbildung 4B) und die Herzmuskelzellen, die rund um die Außenaufnahmen von Mikrofasern (Abb. 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Mikrofluidische Bioprinting Strategie zur Erzeugung von vaskularisierte Gewebe konstruiert. 
(A) Das Design von der Kern-Mantel Koaxial Druckkopf für Co-Extrusion von zusammengesetzten Bioink und CaCl2. (B-E) Diagramme zeigen die Herstellung Verfahren vaskularisierte Gewebe zu konstruieren. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Ref.55geändert. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Bioprinting Microfibrous vaskuläre Bett. 
(A) Foto zeigt ein Bioprinted 30-Schicht Microfibrous Gerüst. (B, C) Oberen und seitlichen Blick auf Mikrographen zeigt ein Bioprinted Gerüst. (D) Lebensfähigkeit der Mediumwechsel beladen in einem Bioprinted-Microfibrous-Gerüst. Grün und Rot zeigen jeweils lebenden und tote Zellen. (E, F) Fluoreszenz Mikrographen zeigt die Organisation der grünen Fuorescent Protein (GFP)-Mediumwechsel in die Bioprinted-Mikrofasern am Tag 0 und Tag 16 post Bioprinting, beziehungsweise. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Anschließende Wachstum von Kardiomyozyten auf dem Schafott Bioprinted Microfibrous. Fluoreszenz Mikrographen zeigen (A) Kerne, (B) zugeschrieben α-Actinin, (C) Connexin-43 und (D) Überlagerung. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Bau des Endothelialized Herzmuskelgewebe. Fluoreszenz Mikrographen zeigen (A) Kerne, GFP-Mediumwechsel (B) , (C) f-Aktin sowohl Mediumwechsel Kardiomyozyten und Überlagerung (D) . In D sehen Sie eine niedrigere Vergrößerung Bild des endothelialized Herzmuskelgewebe. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Dataset. Ein Beispiel G-Code-Datei für Bioprinting ein 6 × 6 mm2 quadratische Gitter mit 220 µm-Abstand zwischen angrenzenden Mikrofasern.

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Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

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Bioengineering

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Serie: Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Forschung

Biotechnik

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Weiterentwicklung des 3D-Bioprintings mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic scaffolds. However, engineering a suitable gel suspension medium that balances precise bioink deposition with cell viability and function presents multiple challenges, particularly in achieving the desired viscoelastic properties. Here, a novel &#954;-carrageenan gel supporting bath is fabricated through an easy-to-operate mechanical grinding process, producing homogeneous sub-microscale particles. These sub-microgels exhibit typical Bingham flow behavior with small yield stress and rapid shear-thinning properties, which facilitate the smooth deposition of bioinks. Moreover, the reversible gel-sol transition and self-healing capabilities of the &#954;-carrageenan microgel network ensure the structural integrity of printed constructs, enabling the creation of complex, multi-layered tissue structures with defined architectural features. Post-printing, the &#954;-carrageenan sub-microgels can be easily removed by a simple phosphate-buffered saline wash. Further bioprinting with cell-laden bioinks demonstrates that cells within the biomimetic constructs have a high viability of 92% and quickly extend pseudopodia, as well as maintain robust proliferation, indicating the potential of this bioprinting strategy for tissue and organ fabrication. In summary, this novel &#954;-carrageenan sub-microgel medium emerges as a promising avenue for embedded bioprinting of exceptional quality, bearing profound implications for the in vitro development of engineered tissues and organs.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung von homogenen κ-Carrageen-Sub-Mikrogel-Bädern für hochauflösendes 3D-Bioprinting

This study introduces a novel &#954;-carrageenan sub-microgel suspension bath, displaying remarkable reversible jamming-unjamming transition properties. These attributes contribute to the construction of biomimetic tissues and organs in embedded 3D bioprinting. The successful printing of heart/esophageal-like tissues with high resolution and cell growth demonstrates high-quality bioprinting and tissue engineering applications.

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

Ingenieurwesen

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Zusammenfassung

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Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen