Name: measurement of metabolic rate in drosophila using respirometry
Uploaded: 2014-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
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Wir möchten die Max-Planck-Gesellschaft für die Finanzierung unserer Forschung danken.

1. Vorbereitung der Respirometer <ol><li> Schneiden Sie die 1.000 ul Pipettenspitze mit einer Rasierklinge, um die Einführung der 50-ul Kapillar-Mikropipette zu ermöglichen, versuchen, die Pipettenspitze so gerade wie möglich zu erhalten. </li><li> Legen Sie ein Stück Schaumstoff in die Pipette und drücken Sie ihn in der Pipettenspitze. </li><li> Eine kleine Menge des CO 2 absorbierenden und enthalten es durch ein zweites Stück Schaumstoff. </li><li> Leim an der Stelle, wo die Mikropipette in die Pipettenspitze eingelegt. </li><li> Verlassen Sie die Respirometer über Nacht, damit der Leim trocknen. Eine schematische Darstellung eines Spiro ist in 1A gezeigt. </li></ol> 2. Herstellung der Messkammer <ol><li> Bereiten Sie die Kammer-Lösung durch Mischen von Wasser mit Eosin in einem Verhältnis, das im sichtbaren Einfärbung führen wird. </li><li> Gießen Sie die Eosin-/ Wasser-Lösung in die Kammer. </li><li> Beschriften Sie eine der Seiten der Kammer mit einer Zentimeter-Skala. </li></ol><ol><li> Beschriften Sie die einzelnen Respirometer mit einem Marker. </li><li> Anesthetize Fliegen mit einer anderen Methode zu CO 2 und legen 3-5 Fliegen des gewünschten Genotyps in jedem Respirometer. </li><li> Verschließen Sie die Respirometer dicht an der Spitze mit Plastilin Kitt. </li><li> Lassen Sie Fliegen von Betäubung für ca. 15 min zu erholen. </li><li> Bereiten Sie eine Respirometer ohne Fliegen, die als die atmosphärische Steuerung verwendet wird. </li></ol> 4. Durchführung des Experiments <ol><li> Hängen die Respirometer in der Kammer, indem ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen Halter, der auf der Oberseite und der Unterseite an der Oberseite der Kammer offen ist. </li><li> Legen Respirometer mit der Mikropipette Spitze nach unten in die Kammer so dass die Spitze in die Farblösung eintauchen. </li><li> In Vaseline zwischen dem Deckelabdeckung und der Kammer, um stärkere Isolation von Temperatur-und Druck fluct bietenuations. </li><li> Schließen Sie den Deckel und lassen Sie das System für 15 Minuten ins Gleichgewicht. </li><li> Machen Sie ein Foto von der Kammer darauf achten, dass der Flüssigkeitsstand innerhalb der einzelnen Mikropipette sichtbar ist und so ist die Skala (siehe Beispiel in Abbildung 1B). </li><li> Nach 1-2 Stunden, nehmen Sie ein anderes Bild. </li><li> Als Experiment ist abgeschlossen, entfernen Sie die Fliegen aus Respirometer und wiegen, wenn gewünscht oder übertragen Sie sie zurück in das Fläschchen, wenn weitere benötigt. </li></ol> 5. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Offene erfassten Bilder mit ImageJ Software 11. </li><li> Mit der Skala in jedem Bild, stellen Sie die Pixel-Skalierung in der Software. </li><li> Den Abstand (&amp;Dgr; d) daß die Flüssigkeit von einem bestimmten Referenzpunkt in den Bildern am Anfang (d1) aufgenommen und zurück Ende des Experiments (d2). Ein schematisches Beispiel ist in Fig. 1C gezeigt. </li><li> Berechnen der Menge an erzeugtem CO 2 (&amp;mgr; l / hr / Fliege) mit der Formel: </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" /> R = Radius der Mikropipette Rohr in cm &amp;Dgr; D = Abstand die Flüssigkeit in der Mikropipette von Testproben in Zentimetern gemessen bewegt &amp;Dgr; C = Abstand die Flüssigkeit in der Mikropipette der negativen Kontrollprobe (ohne entfernt) bewegt n = Anzahl der Fliegen verwendet h = Stunden

<ol>
	<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+&amp;#34;rate+of+living&amp;#34;+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the &amp;#34;rate of living&amp;#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li><li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster.">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).</li><li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+contribution:+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates.">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li><li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li><li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+modulates+metabolic+rate+and+temperature+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temperature+preferences+and+energy+homeostasis+in+dystroglycan+mutants.">Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants.</a> Science. 323, 1740-1743 (2009).</li><li>Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+muscular+dystrophy:+a+genetic+screen+for+dystroglycan+and+dystrophin+interactors+in+Drosophila.+identifies+cellular+stress+response+components.">Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components.</a> Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).</li><li>Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermic+seizures+and+aberrant+cellular+homeostasis+in+Drosophila+dystrophic.+muscles.">Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles.</a> Scientific Reports. 1, 47 (2011).</li><li>Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+metabolism+in+Drosophila+melanogaster:+genetic+correlations+between+life+span+and+age-specific+metabolic+rate+in+populations+artificially+selected+for+long+life.">Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life.</a> Genetics. 169, 231-242 (2005).</li><li>Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+equivalents+of+CO2+and+their+importance+in+assessing+energy+expenditure+when+using+tracer+techniques.">Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques.</a> The American Journal of Physiology. 260, (1991).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Bharucha, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicurean+fly:+using+Drosophila+melanogaster.+to+study+metabolism.">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism.</a> Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode zur Messung der CO 2-Produktion in Fliegen. Wir fanden, dass dieses Experiment ist einfach, schnell durchzuführen und erzeugt reproduzierbare Daten, die in Übereinstimmung mit anderen Studien, 1, 6, 9 ist. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht geändert werden, um Budget und verfügbaren Materialien jedes möglichen Labor passen. Die Konstruktion jedes einzelnen Respirometers kann, solange die Kammer luftdicht bleibt angepasst werden. Je länger, dünner Mikropipetten bieten jedoch mehr Präzision über kürzere. Die Verwendung der äußeren Kammer kann, solange es keine signifikanten Umgebungstemperatur und Druckänderungen, den Versuch beeinträchtigen optional sein. Dies kann durch Analyse der Negativkontrolle und eine große Variabilität in der biologischen Probe Messungen bestimmt werden. Zusätzlich kann das CO 2 absorbierende jeder Sorte, solange es nicht toxisch für den fLügen (zB Kaliumhydroxid). Es ist von äußerster Wichtigkeit, um eine negative Kontrolle, um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt funktioniert haben. Das häufigste Problem ist für die Respirometer nicht vollständig versiegelt werden. Wenn dies der Fall ist, dann wird die Messung vergleichbar mit der Negativkontrolle ist. Zusätzliche Probleme könnten durch Fliegen, die nicht Zeit, sich von der Betäubung erholen hatten oder umgekommen entstehen. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist der Aufbau des Spiro. Wie oben erwähnt, muss die Spiroluftdicht sein. Die Befestigung der Mikropipette auf die größere Kammer muss mit der richtigen Klebstoff verwendet werden. Eine gummiartigen Kleber am besten funktioniert. Es wird empfohlen, die Respirometer unter dem Mikroskop untersuchen, um keine Kompromisse in der Klebestruktur nach Fertigstellung zu beobachten. Darüber hinaus ist die Abdichtung des Spiro nach innen angeordnet sind entfernt worden sehr wichtig. Die Verwendung von Kitt hals erwiesen, am besten funktionieren und nicht selten. Paraffin hat sich herausgestellt, sehr schlecht arbeiten und sollte vermieden werden. Die Flüssigkeit, die verwendet wird, um Gasvolumen zu messen, ist sehr wichtig und sollte manometrischen sein. Wasser ist daher die beste Wahl. Die Verwendung von Tinte wird nicht empfohlen, da es in der Kapillare verhärten was die Respirometer nutzlos. Es ist auch wichtig, nicht zu verwenden, reproduzieren Frauen, als wir merkten, dass ihre CO 2-Produktion kann sehr variabel sein. Neben dem Alter von Fliegen ist daher wichtig, die Fliegen, die verglichen werden sollen im gleichen Alter sein. In unserem Test haben wir 5 Tage alten Männer. Der genetische Hintergrund der Fliegen ist ebenfalls wichtig. Die Kontrollfliegen sollte die gleiche genetische Hintergrund im Vergleich zu Mutanten sein. Die Daten können auch als (&amp;mgr; l / h / mg) durch Messen der Masse der Fliegen nach dem Test, ob es signifikante Unterschiede in der Größe von Fliegen vorgestellt. In unseren Händen wiegt ein Wildtyp-Fliege 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Es sollte auch darauf hingewiesen, dass während des Zeitablaufs des Versuchs, die Werte der Durchschnittsstoffwechselrate erhalten werden. Wir haben auch festgestellt, dass es möglich ist, eine einzelne Fliege messen, aber wir erzielten den höchsten Präzision mit 3-5 Fliegen. Die in Respirometer für Fliegen Raum ist genug, dass sie sich nicht überfüllt, aber zur gleichen Zeit, die sie nicht haben Raum, sich intensiv zu gehen: also defekt Geotaxis sollte keinen Einfluss auf die Höhe der CO 2-Produktion haben. Fliegen sind seit langem als einer der wichtigsten Modellorganismen für die menschliche Krankheiten, die zu Entwicklungsbiologie, Zellbiologie, Neurobiologie und beziehen studieren etabliert. Eine Reihe von aktuellen Studien haben gezeigt, dass Fliegen kann leicht verwendet werden, um Energie-Homöostase als auch studieren (in 12, 13 überprüft) werden. Das hier vorgestellte Verfahren kann leicht in der genetischen Bildschirme verwendet werden, um neue molekulare Komponenten möglicherweise bei der Kontrolle der beteiligten mich identifizierentabolic Zustand vor dem Kauf genauer und teure Ausrüstung. So weit die Mehrheit solcher Bildschirme wurden nur in der Zellkultur getan angibt, dass fortgeschrittene Studien sind gerechtfertigt.

Die biochemischen Krebs-Zyklus erzeugt ATP durch Oxidation von Acetat aus Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen produzieren CO 2 abgeleitet. In Drosophila, O 2-Eingang direkt mit CO 2-Ausstoß korreliert und spiegelt das Niveau des Stoffwechsels ein. So Messung der CO 2-Ausstoß ist erfolgreich in Studien zur Alterung und Stoffwechsel 2-5 Zusammenhang verwendet. Hier unser Labor zuvor entworfen Versuchsaufbauten modifiziert, so dass Messung von CO 2-Produktion in bis zu achtzehn Proben ohne jede Spezialausrüstung erfordern. Andere und wir haben auch bisher diese Methode, um Unterschiede in der Stoffwechselraten in den Fliegen, die einen Mangel in der Muskeldystrophie assoziierten Protein, Dystroglycan (Dg) 6-8 sind zu zeigen. O 2 für oxidativen Stoffwechsel verwendet wird, in CO 2, der als Atemwegs Abfall ausgestoßen wird, umgewandelt wird. Der Baution von Hand hergestellt Respirometer beschrieben, die zur Bestimmung der Rate der O 2-Verbrauch kann. Fliegen werden in einem versiegelten Behälter mit einer Substanz, die CO 2 absorbiert vertrieben werden, mit dem gasförmigen Phase wirksam eliminieren. Die Änderung des Gasvolumens (verminderte Druck) wird durch die Verdrängung des Fluids in einer Glaskapillare mit dem geschlossenen Spiro angebracht war, gemessen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen sind die Kosten. Frühere Studien haben CO 2-Produktion durch Drosophila mit Gasanalysatoren und technisch ausgereifte Systeme Respirometrie 1,9 gemessen. Trotz der komplexeren Geräten ist die Empfindlichkeit der hier beschriebenen Verfahren ähnlich berichteten Werten (Tabelle 1). Darüber hinaus haben mehrere andere Gruppen Varianten dieser Technik verwendet, um relative Stoffwechselraten in Drosophila 4-6 bestimmen. Daher kann dieser Assay verwendet werden, um verlässigen erzeugenle, relevant Drosophila Stoffwechsel ohne den Erwerb von Spezialgeräten, die Konfiguration für jedes Labor sein kann und für pädagogische Zwecke verwendet werden reproduzierbare Daten. Im allgemeinen ist die akzeptierten Techniken, um den Stoffwechsel des Organismus zu bestimmen, messen die CO 2 erzeugt, das O 2 verbraucht oder beides 3,4,9. Obwohl, kann angenommen werden, daß ein Äquivalent von O 2 erzeugt ein Äquivalent von CO 2 ist, das genaue Verhältnis von CO 2 erzeugt wird, ist abhängig von der Stoffwechselsubstrat 10 verwendet. So ist es, um die Stoffwechselrate in Energieeinheiten notwendig, genau zu bestimmen, zu messen, sowohl O 2 verbraucht und CO 2 erzeugt. Aus diesem Grund ist das hier beschriebene Verfahren besonders relevant Vergleich Unterschiede in CO 2-Produktion von Tieren und der Absolutwert. Unsere Technik integriert mehrere Tier CO 2-Produktion über einen Zeitraum von time (1-2 Stunden) und damit gibt eine durchschnittliche Aktivität der Tiere. Wenn es einen Grund zu glauben, dass die Versuchstiere weniger aktiv als bei den Kontrolltieren konnten die Mess verschiedenen Ebenen der Aktivität und nicht unbedingt Stoffwechsel widerspiegeln.

<table><tbody><tr><td>BlauBrand IntraMark 50 &amp;micro;l micropipettes</td><td>VWR</td><td>612-1413</td><td></td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Wako</td><td>CDN6847</td><td></td></tr><tr><td>Eosine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>031M4359</td><td>Any dye that can create visible colorization of liquid can be used</td></tr><tr><td>Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber</td><td>VWR</td><td>21432-761</td><td>Any transparent glass chamber that can be closed with the lid</td></tr><tr><td>Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit</td><td>Flinn</td><td>FB1438</td><td></td></tr><tr><td>Power Gel Glue</td><td>Pritt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipett tips</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaesticine Putty</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of metabolic rate in drosophila using respirometry

Stoffwechselstörungen sind ein häufiges Problem, die die menschliche Gesundheit. Daher ist das Verständnis der Mechanismen, die den Stoffwechsel regulieren, ist eine entscheidende wissenschaftliche Aufgabe. Viele krankheitsverursachenden Gene in Menschen haben eine Fliege Homolog, so dass Drosophila ein gutes Modell, um Signalwege in der Entwicklung verschiedener Erkrankungen beteiligt zu studieren. Zusätzlich wird die Lenkbarkeit von Drosophila vereinfacht genetische Screens bei der Identifizierung neuer therapeutischer Targets, die den Stoffwechsel regulieren kann helfen. Um einen solchen Bildschirm führen eine einfache und schnelle Methode, um Änderungen in der Stoffwechselzustand entfernt ist notwendig, zu identifizieren. Im allgemeinen ist die Produktion von Kohlendioxid ein guter Indikator für die Substratoxidation und Energieaufwand die Bereitstellung von Informationen über die Stoffwechsellage. In diesem Protokoll führen wir eine einfache Methode, um CO 2-Ausstoß von Fliegen messen. Diese Technik kann möglicherweise helfen bei der Identifizierung von genetischen Störungen beeinflussen die Stoffwechselrate.

Um zu zeigen, dass die Methode ist empfindlich uns gemessenen CO 2-Produktion aus dem Wildtyp (Oregon R) männlich fliegt bei 18, 25, und 29 ° C und fliegt Mutante für Dg. Die Fliegen wurden bei 25 ° C erhöht und dann verschoben, um die Versuchstemperatur 5 Tage lang vor der Messung. Wie für diese Art ectothermic erwartet, die Menge an CO 2 erzeugt erhöhte Temperatur (Abbildung 2). Wir haben in der Vergangenheit gezeigt, dass eine zuckerfreie Diät reduziert die Stoffwechselrate sowohl von Wildtyp und Mutante Dg fliegt 7. Der Verlust von Dg führt zu einer erhöhten Stoffwechsellage (Fig. 2). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Aufbau zur Messung der CO 2-Produktion im Fliegen. A. Schematische Darstellung ter Bau der einzelnen Respirometer. B. Foto von der Kammer während der CO 2-Messung. Buchstaben markieren die Position der Respirometer. Vertikale Zahlen zeigen Skala in Zentimetern. C. Schematische Darstellung der Veränderungen während des Experiments. Grüne Linie zeigt Referenzpunkt (d1), blau zeigt die endgültige Position der Flüssigkeit nach 2 Stunden (d2). &amp;dgr; D ist der Abstand der Mikropipette die Flüssigkeit zurückgelegt hat. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. CO 2-Produktion in Fliegen bei unterschiedlichen Temperaturen und in Dg Mutanten. Gehäusetemperatur positiv korreliert mit der CO 2-Produktion in Drosophila und deutlich in Dg Mutanten erhöht. Fehlerbalken zeigen SEM aus vier Einzelexperimenten, *** p ≤ 0.01. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> (Ul / Fliegen x Stunde) </td><td> Ausrüstung verwendet </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> 3.2 CO 2 </td><td> CO 2-Gas-Analysator </td><td> (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) </td></tr><tr><td> 4.68 ± 1.04 CO 2 </td><td> CO 2-System Respirometrie </td><td> (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) </td></tr><tr><td> 2,9-6,2 O 2 </td><td> Ähnlich gestaltet Respirometer </td><td> (Hulbert, Clancy et al. 2004) </td></tr><tr><td> 2,20 ± 0,15 O 2 </td><td> Beschrieben hier handgemachte Respirometer </td><td> (Kucherenko, Marrone et al. 2011) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> * Tabelle sind Werte von Studien, die Zahlenwerte von Fliegen gemessen bei 25 ° C zu melden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vergleichverschiedener Techniken verwendet, um CO 2-Produktion durch Drosophila messen.

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Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Stoffwechselstörungen gehören zu einer der häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die genetisch manipulierbaren Modellorganismus D. melanogaster kann verwendet werden, um neue Gene, die den Stoffwechsel regulieren, zu identifizieren. Dieses Papier beschreibt eine relativ einfache Methode, die die Untersuchung der Stoffwechselrate in Fliegen durch die Messung ihrer CO 2-Produktion ermöglicht.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

19.5K Aufrufe.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry.  Stoffwechselstörungen gehören zu einer der häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die genetisch manipulierbaren Modellorganismus D. melanogaster kann verwendet werden, um neue Gene, die den Stoffwechsel regulieren, zu identifizieren. Dieses Papier beschreibt eine relativ einfache Methode, die die Untersuchung der Stoffwechselrate in Fliegen durch die Messung ihrer CO 2-Produktion ermöglicht. 

Serie: Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Forschung

Biologie

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochemie

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neurowissenschaften

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Adaption der Mikrorespirometrie für Drosophila - Einblicke in den CASK-Mutantenstoffwechsel

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autor im Rampenlicht: Einfluss der Temperatur auf Drosophila melanogaster und wüstenangepasste Käfer 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Messung desO2-Verbrauchs in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Messung der Stoffwechselrate in

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Messung der Lebensdauer in

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in

Die Messung der Aktivität in der Larven

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Messung des_{O2-Verbrauchs} in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Messung des_{O2-Verbrauchs} in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie