Name: measurement of metabolic rate in drosophila using respirometry
Uploaded: 2014-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Max-Planck Society per finanziare la nostra ricerca.

1. Preparazione di Respirometri <ol><li> Tagliare la punta della pipetta 1.000 microlitri con una lametta per consentire l&#39;inserimento del capillare micropipetta 50 pl, cercare di ottenere il puntale più diritta possibile. </li><li> Posizionare un pezzo di schiuma nella pipetta e spingerla verso il basso nella punta della pipetta. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di CO 2 assorbente e contenere entro un secondo pezzo di schiuma. </li><li> Applicare la colla nel luogo in cui la micropipetta viene inserito nella punta della pipetta. </li><li> Lasciare il respirometro durante la notte per permettere la colla si asciughi. Uno schema di un respirometro è mostrato nella Figura 1A. </li></ol> 2. Preparazione della camera di misura <ol><li> Preparare la soluzione da camera di miscelazione acqua con eosina in un rapporto che si tradurrà in colorazione visibile. </li><li> Versare la soluzione eosina / acqua nella camera. </li><li> Etichettare uno dei lati della camera con una scala centimetro. </li></ol><ol><li> Etichettare le singole respirometri con un pennarello. </li><li> Anestetizzare mosche utilizzando un metodo alternativo di CO 2 e posizionare 3-5 mosche del genotipo desiderato all&#39;interno di ogni respirometro. </li><li> Sigillare le respirometri saldamente in cima utilizzando plastilina stucco. </li><li> Consentire mosche per recuperare da anestesia per circa 15 min. </li><li> Preparare una respirometro senza linea, che sarà utilizzato come controllo atmosferica. </li></ol> 4. Esecuzione dell&#39;esperimento <ol><li> Appendere le respirometri nella camera collegando un titolare Eppendorf da 1,5 ml tubo che è aperto nella parte superiore e la parte inferiore alla parte superiore della camera. </li><li> Inserire respirometri con la punta micropipetta giù nella camera che la punta di immergersi nella soluzione colorata. </li><li> Aggiungere vaselina tra il coperchio coperchio e camera per fornire l&#39;isolamento forte dalla temperatura e pressione fluctuations. </li><li> Chiudere il coperchio e lasciare il sistema si stabilizzi per 15 min. </li><li> Prendere una fotografia della camera di fare in modo che il livello di liquido all&#39;interno di ciascuna micropipetta è visibile e quindi è la scala (vedi esempio illustrato nella Figura 1B). </li><li> Dopo 1-2 ore, scattare un&#39;altra foto. </li><li> Quando esperimento è finito, rimuovere le mosche dal respirometri e pesare se desiderato o il trasferimento di nuovo al flaconcino, se necessario ulteriormente. </li></ol> 5. Analisi dei risultati <ol><li> Apri immagini acquisite utilizzando il software ImageJ 11. </li><li> Utilizzando la scala in ogni immagine, impostare la scalatura pixel nel software. </li><li> Misurare la distanza (Δd) che il liquido ha viaggiato da un punto di riferimento determinato in immagini scattate all&#39;inizio (d1) e alla fine dell&#39;esperimento (d2). Un esempio schematico è mostrato nella Figura 1C. </li><li> Calcolare la quantità di CO 2 prodotta (ml / h / volo) con la formula: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" /> R = raggio del tubo micropipetta in centimetri Δd = distanza il liquido è spostato nella micropipetta di campioni di prova misurata in centimetri Δc = distanza il liquido è spostato nella micropipetta del campione di controllo negativo (senza linea) n = numero di mosche utilizzati h = ore

<ol>
	<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+&amp;#34;rate+of+living&amp;#34;+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the &amp;#34;rate of living&amp;#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li><li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster.">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).</li><li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+contribution:+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates.">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li><li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li><li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+modulates+metabolic+rate+and+temperature+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temperature+preferences+and+energy+homeostasis+in+dystroglycan+mutants.">Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants.</a> Science. 323, 1740-1743 (2009).</li><li>Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+muscular+dystrophy:+a+genetic+screen+for+dystroglycan+and+dystrophin+interactors+in+Drosophila.+identifies+cellular+stress+response+components.">Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components.</a> Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).</li><li>Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermic+seizures+and+aberrant+cellular+homeostasis+in+Drosophila+dystrophic.+muscles.">Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles.</a> Scientific Reports. 1, 47 (2011).</li><li>Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+metabolism+in+Drosophila+melanogaster:+genetic+correlations+between+life+span+and+age-specific+metabolic+rate+in+populations+artificially+selected+for+long+life.">Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life.</a> Genetics. 169, 231-242 (2005).</li><li>Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+equivalents+of+CO2+and+their+importance+in+assessing+energy+expenditure+when+using+tracer+techniques.">Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques.</a> The American Journal of Physiology. 260, (1991).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Bharucha, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicurean+fly:+using+Drosophila+melanogaster.+to+study+metabolism.">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism.</a> Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo protocollo, si descrive un metodo poco costoso ed affidabile per misurare la produzione di CO 2 in mosche. Abbiamo trovato che questo esperimento è facile, rapida da condurre e genera dati riproducibile che è in accordo con altri studi 1, 6, 9. Il protocollo qui descritto può essere facilmente modificato per adattarsi bilancio e disponibili materiali di qualsiasi laboratorio. La costruzione di ogni singolo respirometro può essere adattato finché la camera rimane chiuso ermeticamente. Tuttavia, il più lungo, micropipette sottili offrono più precisione rispetto a quelli brevi. L&#39;uso della camera esterna può essere facoltativo finché ci sono significative variazioni di temperatura e pressione ambiente per compromettere l&#39;esperimento. Questo può essere determinato mediante analisi del controllo negativo e una grande variabilità all&#39;interno misurazioni di campioni biologici. Inoltre, la CO 2 assorbente può essere di qualsiasi varietà finché non è tossico per la fbugie (ad esempio idrossido di potassio). E &#39;estremamente importante avere un controllo negativo per assicurare che la tecnica funziona correttamente. Il problema più comune è per il respirometro non da sigillare completamente. Se questo è il caso, allora la misura sarà paragonabile a quella del controllo negativo. Ulteriori problemi potrebbero sorgere a causa di mosche che non hanno avuto il tempo per recuperare da anestesia o sono morti. La fase più critica in questo protocollo è la costruzione del respirometro. Come notato sopra, la respirometro deve essere a tenuta stagna. Il fissaggio della micropipetta per la grande camera pipetta deve essere fatto con la colla corretta. Un adesivo più simile alla gomma ha funzionato meglio. Si consiglia di ispezionare i respirometri al microscopio per osservare compromessi nella struttura incollato dopo il completamento. Inoltre, la tenuta della respirometro dopo linea sono state collocate all&#39;interno è molto importante. L&#39;uso di mastice hcome stato trovato a lavorare meglio e non riesce di rado. Paraffina è stato trovato a lavorare molto male e deve essere evitato. Il liquido che viene utilizzato per misurare il volume di gas è anche molto importante e dovrebbe essere manometrica. L&#39;acqua è quindi la scelta migliore. L&#39;uso di inchiostro non è raccomandato perché può indurire nel capillare rendendo il respirometro inutile. E &#39;anche fondamentale non usare riprodurre femmine, come abbiamo notato che la loro produzione di CO 2 può essere molto variabile. Inoltre l&#39;età di mosche è importante, quindi in linea che sono confrontati dovrebbero essere della stessa età. Nel nostro test abbiamo utilizzato 5 giorni vecchi maschi. Il background genetico delle mosche è anche importante. Linea di controllo devono essere dello stesso sfondo genetico rispetto a mutanti. I dati possono anche essere presentate come (ml / h / mg), misurando la massa di linea dopo aver eseguito il test se ci sono differenze significative nella dimensione di mosche. Nelle nostre mani, un tipo selvaggio mosca pesa 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Va inoltre sottolineato che, durante la temporizzazione dell&#39;esperimento, si ottengono i valori del tasso metabolico medio. Abbiamo anche trovato che è possibile misurare una mosca individuo, ma abbiamo raggiunto la massima precisione utilizzando 3-5 mosche. Lo spazio disponibile in respirometro per le mosche è sufficiente che essi non si sentono affollata, ma allo stesso tempo non hanno spazio per camminare intensamente: quindi geotassi difettosi non dovrebbero avere alcun effetto sul livello di produzione di CO 2. Le mosche sono stati a lungo affermato come uno dei principali organismi modello per studiare le malattie umane che sono legati alla biologia dello sviluppo, biologia cellulare e neurobiologia. Un certo numero di studi recenti hanno dimostrato che in linea possono facilmente essere utilizzati per studiare l&#39;omeostasi energetica nonché (recensito in 12, 13). Il metodo qui presentato può essere facilmente utilizzato in schermi genetici per identificare nuovi componenti molecolari possibilmente coinvolti nel controllo della mestato tabolic prima di acquistare attrezzature più accurato e costoso. Finora la maggior parte di questi schermi è stato fatto solo in colture cellulari che indica che gli studi più avanzati sono garantiti.

Il ciclo di Krebs biochimico genera ATP attraverso l&#39;ossidazione di acetato derivata dai carboidrati, grassi e proteine ​​che producono CO 2. In Drosophila, O 2 ingresso è direttamente correlata con CO 2 uscita e riflette il livello di metabolismo 1. Così, la misurazione di CO 2 in uscita è stato usato con successo in studi legati all&#39;invecchiamento e metabolismo 2-5. Qui il nostro laboratorio ha modificato apparati sperimentali progettati in precedenza, consente la misurazione della produzione di CO 2 fino a diciotto campioni senza bisogno di attrezzature specializzate. Altri e abbiamo già utilizzato questo metodo per mostrare le differenze nei tassi metabolici in linea che sono carenti nella distrofia muscolare proteina associata, distroglicano (DG) 6-8. O 2 utilizzati per il metabolismo ossidativo è convertito in CO 2, che viene espulso come rifiuti respiratorio. La costruzionezione respirometri fatti a mano viene descritto che permette la determinazione del tasso di O 2 consumato. Mosche sono posti in un contenitore sigillato con una sostanza che assorbe espulso CO 2, eliminando efficacemente dalla fase gassosa. La variazione di volume di gas (diminuzione della pressione) è misurata dallo spostamento di liquido in un capillare di vetro attaccato alla respirometro chiuso. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri è il costo. Precedenti studi hanno misurato produzione di CO 2 da Drosophila utilizzando analizzatori di gas e sistemi di RESPIROMETRICO tecnicamente avanzati 1,9. Nonostante l&#39;apparecchiatura più complessa, la sensibilità del metodo qui descritto è simile ai valori riportati (Tabella 1). Inoltre, diversi altri gruppi hanno utilizzato varianti di questa tecnica per determinare i tassi metabolici relativi in Drosophila 4-6. Pertanto, questo test può essere utilizzato per generare attendibilile, i dati riproducibili relativi al metabolismo Drosophila, senza l&#39;acquisto di attrezzature specializzate che può essere installato in qualsiasi laboratorio e può essere utilizzato per scopi didattici. In generale, le tecniche riconosciute per determinare il metabolismo di un organismo è misurare la CO 2 prodotta, l&#39;O 2 consumato, o entrambi 3,4,9. Anche se, si può presumere che un equivalente di O 2 genera un equivalente di CO 2, il rapporto precisa del CO 2 generata dipende sul substrato metabolico utilizzato 10. Così, per determinare con precisione il tasso metabolico in energia è necessario misurare sia O 2 consumato e CO 2 prodotta. A causa di questo, il metodo qui descritto è specificamente rilevante per confrontare le differenze fra CO 2 produzione tra gli animali e non il valore assoluto. La nostra tecnica si integra aerei animale produzione di CO 2 per un periodo di time (1-2 ore) e quindi restituisce una media di attività degli animali. Se non vi è motivo di ritenere che gli animali sperimentali sono meno attivi rispetto agli animali di controllo la misura potrebbe riflettere i diversi livelli di attività e non necessariamente il metabolismo.

<table><tbody><tr><td>BlauBrand IntraMark 50 &amp;micro;l micropipettes</td><td>VWR</td><td>612-1413</td><td></td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Wako</td><td>CDN6847</td><td></td></tr><tr><td>Eosine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>031M4359</td><td>Any dye that can create visible colorization of liquid can be used</td></tr><tr><td>Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber</td><td>VWR</td><td>21432-761</td><td>Any transparent glass chamber that can be closed with the lid</td></tr><tr><td>Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit</td><td>Flinn</td><td>FB1438</td><td></td></tr><tr><td>Power Gel Glue</td><td>Pritt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipett tips</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaesticine Putty</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of metabolic rate in drosophila using respirometry

Disturbi metabolici sono un problema frequente che colpisce la salute umana. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che regolano il metabolismo è un compito scientifico fondamentale. Molti geni che causano malattie negli esseri umani hanno un omologo mosca, rendendo Drosophila un buon modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di malattie diverse. Inoltre, la trattabilità di Drosophila semplifica schermi genetici per aiutare a identificare nuovi bersagli terapeutici che possono regolare il metabolismo. Per eseguire tale schermata è necessario un metodo semplice e veloce per identificare le variazioni dello stato metabolico di mosche. In generale, la produzione di anidride carbonica è un buon indicatore di ossidazione del substrato ed il dispendio energetico fornire informazioni sullo stato metabolico. In questo protocollo si introduce un metodo semplice per misurare la CO 2 in uscita dalle mosche. Questa tecnica può potenzialmente aiutare nell&#39;identificazione di perturbazioni genetiche che colpiscono tasso metabolico.

Al fine di dimostrare che il metodo è sensibile abbiamo misurato la produzione di CO 2 da wild type (Oregon R) maschile vola a 18, 25, e 29 ° C e vola mutante per Dg. Mosche sono state sollevate a 25 ° C e poi spostato alla temperatura sperimentale per 5 giorni prima della misura. Come previsto per questa specie ectotermi, la quantità di CO 2 prodotta aumentata con la temperatura (Figura 2). Abbiamo in passato dimostrato che una dieta priva di zucchero riduce il tasso metabolico sia di tipo selvatico e mutante vola Dg 7. La perdita di Dg porta ad aumento dei livelli metabolici (Figura 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Impostazione di misurazione della produzione di CO2 in linea. A. schematica tegli costruzione del respirometro individuo. B. fotografico della camera durante la misurazione di CO 2. Lettere segnano la posizione di respirometri. Numeri verticali indicano scala in centimetri. C. schematica che mostra le variazioni durante l&#39;esperimento. Linea verde indica punto di riferimento (d1), blu indica la posizione finale del liquido dopo 2 ore (d2). Δd è la distanza il liquido ha viaggiato nel micropipetta. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Produzione di CO 2 in linea a diverse temperature e in mutanti Dg. Temperatura Housing correla positivamente con produzione di CO2 in Drosophila ed è significativamente aumentata nei mutanti Dg. Le barre di errore indicano SEM da quattro esperimenti singoli, *** p ≤ 0.01. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> (Pl / fly x ora) </td><td> Attrezzatura utilizzata </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> 2-3 di CO 2 </td><td> Analizzatore di gas CO 2 </td><td> (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) </td></tr><tr><td> 4.68 ± 1.04 di CO 2 </td><td> CO 2 Sistema respirometria </td><td> (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) </td></tr><tr><td> 2,9-6,2 O 2 </td><td> Respirometri Analogamente progettati </td><td> (Hulbert, Clancy et al. 2004) </td></tr><tr><td> 2.20 ± 0.15 O 2 </td><td> Descritto respirometri qui fatti a mano </td><td> (Kucherenko, Marrone et al. 2011) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> * Valori della tabella sono da studi che riportano i valori numerici di mosche misurate a 25 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Confrontodelle diverse tecniche utilizzate per misurare la produzione di CO 2 da Drosophila.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry at JoVE.com

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Disturbi metabolici sono tra una delle malattie più comuni negli esseri umani. Il modello di organismo geneticamente trattabili D. melanogaster può essere utilizzato per identificare nuovi geni che regolano il metabolismo. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice, che permette lo studio del metabolismo in linea misurando la produzione di CO 2.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

measurement-of-metabolic-rate-in-drosophila-using-respirometry

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

19.5K Views.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry.  Disturbi metabolici sono tra una delle malattie più comuni negli esseri umani. Il modello di organismo geneticamente trattabili D. melanogaster può essere utilizzato per identificare nuovi geni che regolano il metabolismo. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice, che permette lo studio del metabolismo in linea misurando la produzione di CO 2. 

Video: Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Ricerca

Biologia

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochimica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neuroscienze

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Misura della larvali attività nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Adattamento della microrespirometria per la Drosophila - Approfondimenti sul metabolismo dei mutanti CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autore in primo piano: Influenza della temperatura su Drosophila melanogaster e coleotteri adattati al deserto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Misurazione del tasso metabolico in

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Misura della durata della vita in

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo

Misura della larvali attività nel

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Misurazione del consumo di O₂ in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Misurazione del consumo di O₂ in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica