Analyse der bakteriellen Wachstumskurve und ihre Umweltanwendungen

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Bakterien gehören zu den am häufigsten vorkommenden Lebensformen auf der Erde. Sie sind in jedem Ökosystem gefunden und sind von entscheidender Bedeutung für den Alltag. Zum Beispiel Bakterien beeinflussen, was die Leute Essen, trinken und atmen, und es gibt tatsächlich mehr bakterielle Zellen im Körper einer Person als Säugerzellen. Aufgrund der Bedeutung von Bakterien ist es vorzuziehen, bestimmte Arten von Bakterien im Labor zu untersuchen. Dazu werden Bakterien unter kontrollierten Bedingungen angebaut, in Reinkultur, was bedeutet, dass nur eine Art von Bakterium erwogen wird. Bakterien wachsen schnell in Reinkultur, und Zellzahlen in kurzer Zeit dramatisch zunehmen. Durch die Messung der Rate der Zellpopulation zu erhöhen, im Laufe der Zeit eine "Wachstumskurve" entwickelt werden. Dies ist wichtig, wenn mit dem Ziel, nutzen oder impfen bekannte Nummern des bakteriellen Isolats, zum Beispiel um Pflanzenwachstum zu verbessern, die biologischen Abbau giftiger organischer Stoffe oder Antibiotika oder andere natürliche Produkte im industriellen Maßstab zu produzieren.

Bakterielle Vermehrung erfolgt über binäre Spaltung, in der eine bakterielle Zelle teilt sich und wird von zwei Zellen (Abbildung 1). Der Zeitaufwand für die Zellteilung ist bekannt als die mittlere Generation Zeit oder Verdopplungszeit, ist der Zeitaufwand für die Anzahl der Zellen zu verdoppeln.

Abbildung 1: Exponentielle Zellteilung. Jeder Zellteilung führt zu einer Verdoppelung der Anzahl von Zellen. Bei niedrigen Zellzahlen ist die Erhöhung nicht sehr groß; aber nach ein paar Generationen Zelle Zahlen Erhöhung explosionsartig. Nach n Divisionen gibt es 2ⁿ Zellen.

Zu verstehen und das Wachstum von bestimmten Mikroorganismen zu definieren, werden sie in ein Auffanggefäß platziert, wo die Nährstoffversorgung und Umweltbedingungen gesteuert werden. Wenn das flüssige Medium alle Nährstoffe, die für Wachstum und Umweltparameter förderlich für Wachstum benötigt liefert, kann der Anstieg der Zahlen als Funktion der Zeit zu einer Wachstumskurve gemessen werden. Mehrere unterschiedliche Wachstumsphasen können innerhalb einer Wachstumskurve (Abbildung 2) beobachtet werden. Dazu gehören die Lag-Phase, die exponentielle oder Log-Phase, die stationäre Phase und der Tod-Phase, von denen jede spezifische physiologische Veränderungen (Tabelle 1) zugeordnet sind.

Phase	Merkmale
Lag-Phase	Langsames Wachstum oder Mangel an Wachstum durch physiologische Anpassung der Zellen, die Kulturbedingungen oder Verdünnung der Exoenzymes aufgrund der anfänglichen niedrigen Zelldichten.
Exponentielle oder Log-Phase	Optimale Wachstumsraten, während die Zellzahlen Doppel in diskreten Zeitintervallen die mittlere Generationszeit genannt.
Stationäre Phase	Wachstum (Zellteilung) und Absterben der Zellen untereinander, wodurch keine Nettozunahme Zellzahlen Gegengewicht. Das geringere Wachstum ist in der Regel durch einen Mangel an Nährstoffen und/oder eine Ansammlung von toxischen Abfällen Bestandteile.
Tod-Phase	Sterberate übersteigt die Wachstumsrate, was zu einem Nettoverlust von entwicklungsfähigen Zellen.

Tabelle 1. Die vier Phasen des Bakterienwachstums.

Abbildung 2: Eine typische Wachstumskurve für eine Bakterienpopulation. Vergleichen Sie die Form der Kurven basierend auf koloniebildenden Einheiten (KBE) im Vergleich zu optischen Dichte, vor allem in den Tod-Phase. Der Unterschied ist, dass abgestorbene Zellen Ergebnis der Trübung noch, aber können nicht lebensfähige Kolonien in Kultur bilden.

Insgesamt ist es oft entscheidend für Bakterienwachstum Kinetik für einen bestimmten bakteriellen Isolat zu bestimmen, um die Anzahl der bakteriellen Zellen in das flüssige Medium kennen. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um Wachstum in einem flüssigen Medium, einschließlich Trübung Messungen mit einer kolorimetrischen Spektralphotometer und serielle Verdünnung Beschichtung zu messen. Trübung Messungen verlassen sich auf die Tatsache, dass je mehr Zellen in das flüssige Medium, das mehr trübe Flüssigkeit wird. Serielle Verdünnung Überzug beinhaltet prüfen die Anzahl der Zellen in das flüssige Medium, das tragfähige Kolonien auf solide Kultur, eine Messung, bekannt als die Kultur "Koloniebildenden Einheiten" bilden können. Beachten Sie jedoch, dass diese Beschichtung Assays nur für Bakterien verwendet werden können, sind in der Tat sind.

1. Erhebung der Bakterienkultur Aliquote

1. Impfen Sie einen Tag vor der Abholung von Wachstum Zeitpunkten 20 mL Trypticase-Soja Brühe (TSB) Medium in eine 50-mL-Flasche mit E. Coli.
2. Inkubation über Nacht bei 27 ° C. Diese relativ langen Inkubationszeit führt zu einer stationären Phase Bevölkerung von Wildtyp E. Coli von ca. 10⁹ KBE/mL.
3. Am nächsten Tag verwenden Sie 100 µL der vorbereiteten Kultur 250 mL TSB (in einen 500-mL-Kolben) zu impfen. Mischen Sie gründlich.  Eine 5-mL-aliquoten zu entfernen und in den Kühlschrank sofort bei 4 ° C. Dies ist T = 0 oder T₀ Zeitpunkt, und sollte ca. 4 x 10⁵ KBE/mL enthalten.
4. Legen Sie den Kolben des verbleibenden E. Coli (245 mL) in einem 37 ° C Inkubator schütteln. 5-mL-aliquoten Kultur stündlich zu entfernen, bis zu 8 h. speichern jedes aliquoten bei 4 ° C. Benennen Sie diese Aliquote T₁ bis T₈.

2. serielle Verdünnung

1. Aliquote von E. Coli aus dem Kühlschrank und auf Eis für den Transport zu entfernen. Halten Sie alle Kulturen auf Eis bis zur Verwendung.
2. Richten Sie eine Reihe von Verdünnung Rohren zu verschiedenen Verdünnungen der jeweiligen E. Coli -Kultur (Abbildung 3). Microfuge Röhren eignen sich für diese Funktion. Jedes Rohr Verdünnung sollten 900 µL Verdünnung Flüssigkeit (sterile Kochsalzlösung) haben. Eine Verdünnungsreihe ist erforderlich für jede Kultur E. Coli (T₀ bis T₈); Beschriften Sie jedes Rohr nach Tabelle 2.
   
   Abbildung 3. Schaltplan zeigt das Verfahren für die Beschichtung von E. Coli.
3. Verdünnungen durch Zugabe von 100 µL von E. Coli aus der Tube mit der Bezeichnung T₀ beginnen (die ursprüngliche E. Coli Kultur) Rohr A, die die 10^-1 Verdünnung T₀ist. Wirbel der Röhre für 5 s.
4. Anschließend fügen Sie 100 µL Rohr A an das nächste Rohr der Saline, Rohr B hinzu, die die 10^-2 Verdünnung T₀. Die notwendige Verdünnung-Serie für jede Zeitpunkt aliquoten weiter. Denken Sie daran, Wirbel jedes Rohr vor der Übertragung. Es ist auch wichtig, eine neue Pipettenspitze für jede Übertragung zu verwenden.

E. Coli -Kultur	Verdünnungen erforderlich und Tube #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T-3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T-7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T-8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tabelle 2. Verdünnungsreihen notwendig für jede E. Coli -Kultur.

3. Beschichtung

1. Drei Verdünnungen für jedes E. Coli Kultur Zeitpunkt aliquoten werden gemäß Tabelle 3überzogen werden. Label-Platten mit der Zeitpunkt (T₁ bis T-₈), den Verdünnungsfaktor und Volumen hinzugefügt werden. Verwenden Sie dreifacher Platten für jede Verdünnung.
2. Die Platte fügen Sie 100 µL jeder Verdünnung durch Pipettieren des Betrags in die Mitte der Agarplatte (Abbildung 3 hinzu). Sofort verbreiten sterilisiert die aliquoten durch den Einsatz einer Flamme "L"-förmige Glasstab. Wenn die aliquoten nicht sofort verteilt ist, Sorben es in Situ auf der Platte, wodurch bakterielle Überwucherung an der Stelle der ersten Impfung.
3. Wiederholen Sie die Beschichtung für jedes Verdünnungsreihe zur Zeit Punkte T₁ bis T₈. Denken Sie daran, die Rute zwischen den Platten und vor allem zwischen verschiedenen Verdünnungen zu sterilisieren.
4. Sobald Platten für ein paar Minuten getrocknet haben, umdrehen und über Nacht bei 37 ° C Inkubator legen. Invertieren der Platten Kondensation auf der Agarplatte fallen entgegen. Platten sollten nach Inkubation über Nacht im Kühlschrank gelagert werden.

E. coli Kultur	Verdünnungen, beschichtet werden
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T-3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7 *	10-5	10-6	10-7
T8 *	10-4	10-5	10-6

^* Niedrigere Verdünnungen berücksichtigen geringere Populationen durch Tod Phase.

Tabelle 3. Protokoll für E. Coli Kulturen plating.

4. zählen Kolonien und mittlere Generationszeit rechnen

1. Platten für Einheitlichkeit der Kolonien und Mangel an Kontamination zu untersuchen.
2. Wählen Sie für jeden Zeitpunkt (T₀ bis T₈) eine Verdünnung, die zwischen 30 und 300 Kolonien und Graf dreifacher Platten enthält.
3. Berechnen Sie mit Hilfe den Verdünnungsfaktor, Rücken-die Anzahl der Zellen pro mL der ursprünglichen Kultur auf Zeit Punkte T₀ bis T₈. Zum Beispiel, wenn die Anzahl der Kolonien, die aus einer 10^-4 Verdünnung 30, 28 und 32:
   Mittlere Anzahl der Kolonien = 30 Kolonien
   Diese entstand aus 0,1 mL einer 10^-4 Verdünnung
   Anzahl der Kolonien pro mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Plot-Log₁₀ KBE/mL im Vergleich zur Zeit (in Stunden).
5. Aus dem Diagramm ermitteln der exponentiellen Wachstumsphase. Mit 2 Zeitpunkten innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase und die entsprechende Zelle Zahlen zu jedem Zeitpunkt, berechnen Sie die mittlere Generationszeit.

Im Anschluss an eine serielle Verdünnung plating-Experiment wurde folgenden Daten erhalten. Zu Beginn des exponentiellen Wachstums bezeichnet hier als Zeitpunkt t = 0, die Ausgangskonzentration von Bakterienzellen ist 1.000 KBE/mL. Zum Zeitpunkt t = 6 h, die Konzentration der Zellen ist 16.000 KBE/mL.

Nun, X = 2ⁿ X X₀

Wo: X₀ = Anfangskonzentration der Zellen = 1.000 KBE/mL
X = Konzentration der Zellen nach der Zeit t = 16.000 KBE/mL
n = Anzahl der Generationen
16.000 = 2ⁿ X 1,000
2ⁿ = 16
Melden Sie sich₁₀ 2ⁿ = Log₁₀ 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301

Vier Generationen für 6 h, also abgelaufen

Meine Generationszeit = 6/4 = 1.5 h.

Abbildung 4. Ein Stamm-Knötchen, die Stickstoff-fixierenden Bakterien enthält.

Kenntnisse von Bakterienwachstum Kinetik und bakterielle Zahlen in einem Nährmedium ist aus einer Forschungs- und kommerzieller Sicht wichtig. In der Forschung ist es oft wichtig zu wissen, die Anzahl der Bakterien in einer Probe, also Experiments kann, repliziert werden wenn nötig, mit den exakten gleichen Zahlen. Zum Beispiel während der Experimente in denen bakterielle Impfkulturen auf einem Grundstück von Boden, ein Minimum von 10⁴ KBE pro Gramm Boden um den gewünschten Effekt, wie verstärkten Abbau von Schadstoffen im giftigen organischen Boden hinzugefügt werden muss hinzugefügt werden. Ein weiteres Beispiel ist der Fall des kommerziell produzierten rhizobial Inokula, wo bekannte Rufnummern der Rhizobien (Bakterien, die symbiotische Beziehungen mit den Wurzeln der Pflanzen eingehen) in ein Torf-basierten Carbon Medium (Abbildung 4) imprägniert sind. Das Medium wird dann verwendet, um Leguminosen-Samen zur Verbesserung der biologischen Stickstofffixierung (d.h. die Umwandlung von molekularem Stickstoff in organischen Formen, die von Organismen als Nährstoffe verwendet werden können) zu impfen.

Wachstum-Kinetik ist auch nützlich für die Beurteilung, ob bestimmte Bakterienstämme angepasst werden, um bestimmten Substraten, wie z. B. Industrieabfälle oder Ölverschmutzung zu metabolisieren. Bakterien, die gentechnisch, zur Reinigung von Ölverschmutzungen verändert sind, können beispielsweise angebaut werden, im Beisein von komplexen Kohlenwasserstoffen um sicherzustellen, dass ihr Wachstum durch die toxische Wirkung des Öls nicht unterdrückt werden würde. Ebenso können die Neigung und die Form der Wachstumskurven aus Bakterien gewachsen mit einer Mischung aus industriellen Abfallprodukten produziert Wissenschaftler informieren, ob die Bakterien enthaltenen Substanz verstoffwechseln können, und wie viele potentielle Energie-Quellen für die Bakterien in der Abfall-Mischung zu finden.