Isolierung von fäkalen Bakterien aus Wasserproben durch Filtration

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Die Qualität des Wassers für den Einsatz in Landwirtschaft, Freizeit- und inländischen Einstellungen bestimmt ist von großer Bedeutung wegen des Potentials für den Ausbruch von Wasser übertragenen Krankheit. Mikrobielle Mittel in solche Ereignisse verwickelt sind Parasiten, Bakterien und Viren, die Schuppen sind in hohen Stückzahlen in den Kot von infizierten Menschen und Tieren. Übertragung auf neue und anfällig für Hosts kann dann über den fäkal-oralen Weg nach Verschlucken von kontaminiertem Wasser auftreten. Daher ist die Fähigkeit, Wasser-Quellen auf das Vorhandensein von pathogenen Mikroorganismen überwachen erhebliche zur Sicherstellung der öffentlichen Gesundheit.

Durch die schiere Anzahl und Vielfalt potentieller fäkal-Oral-Erreger, die in Wasser und deren Variable Konzentrationen vorhanden sein können, ist es unpraktisch und teuer, um direkt für jeden einzelnen von ihnen in regelmäßigen Abständen zu überprüfen. Deshalb beschäftigen die mikrobiologische Assays für die Überwachung der Wasserqualität coliforme Indikatorbakterien. Coliformen umfassen, im Teil, der normale Darmflora von warmblütigen Säugetieren sind apathogen und sind konsequent in den Kot ausgeschieden. Daher bedeutet der Nachweis von coliformen Bakterien im Wasser, dass eine fäkale-Release stattgefunden, und schädliche pathogene Mikroorganismen auch vorhanden sein können.

Die Membran-Filtration-Technik wird verwendet, um die mikrobiologische Qualität des Wassers durch Prüfung für fäkale Indikatorbakterien zu beurteilen. Eine Menge Wasser (z.B. 100 mL) wird durch eine spezielle Membranfilter mit einer minimalen mittleren Porengröße von 0,45 µm, erleichtert die Erfassung von Bakterien, wie sie etwa 1 µm groß sind übergeben. Nach Filtration die Membrane ist sorgfältig auf einem spezialisierten Agarose-Nährmedium aufgebracht, und inkubiert unter den Bedingungen entsprechende Ziel Mikroorganismen Kultur.

Bei Anwendung für den Einsatz in der Überwachung der Wasserqualität ist die Membranfiltration ideal für geringe Trübung Quellen wie Trinkwasser, Schwimmbäder und natürliche Freizeit Gewässer wie Seen und Stauseen. Verschmutzung des Filters werden Gewässer reich an Feinstaub (z.B. Rohabwasser) führen; Daher, nur kleinere Mengen (z. B. 100 mL) analysiert werden kann. Membranfiltration ist auch nicht praktisch für Wasser-Quellen mit zahlreicher Hintergrund (oder nicht-Coliform) Bakterien, die die Schwierigkeit der aufzählen Ziel coliforme Bakterien auf die Agarose mittlere folgende Inkubation erhöhen können.

Dieses Video zeigt die Sammlung von Trinkwasser und Umweltschutz Wasserproben, die Membranfiltration von Proben und die Enumeration von mehreren Arten von fäkalen Indikator Bakterienkolonien mit spezialisierten Agarose Wachstumsmedien einschließlich insgesamt Coliformen, fäkalen Coliformen und fäkale Enterokokken. Weiter Tests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die mutmaßliche Kolonien auch gezeigt werden.

1. Wasser Probengewinnung und Verarbeitung

1. Mehrere 1-L-Wasserproben aus der Test-Wasser-Quelle zu sammeln (z. B. Brunnen, Schwimmbecken, Stauseen, Wasserverteilungssystemen, roh oder behandeltes Abwasser), und Verkehr auf dem Eis in das Labor zur mikrobiellen Analyse.
2. Sterilisieren Sie oder desinfizieren Sie die Membran-Filtration Verteileranordnung vor Nutzung durch Autoklavieren, Einwirkung von UV-Bestrahlung (2 min) oder Ethanol-Flamme-Zündung.
3. Verbinden Sie beim Abkühlen von allen Teilen richtig, Krümmer, eine Vakuumpumpe und Vakuum Filtration Abfall Flasche mit Bleichmittel.
4. Ethanol-Flamme ein paar Zangen und mit ihnen zu sterilisieren, steril, gerasterten Membranfilter aus der Verpackung nehmen. 47 mm im Durchmesser mit einer Porengröße von 0,45 µm Membranen sind in der Regel verwendet. Jedoch wechseln sich Durchmesser und Porengrößen eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass die Porengröße kann die Ziel-Anmelder ausreichend verleiten, und mindestens 70 % der Filterfläche des Porenraumes besteht.
5. Setzen Sie den Filter auf die Mitte des Bereichs Membran Filtration des Verteilers, und gelten Sie einen Sterilfilter Trichter für das Gerät und sichern Sie ihn einrasten.
6. Gewünschten Wassermenge Test zu messen (z. B. 100 mL) und fügen sie Sie den Trichter (eine 100-mL-Linienmarkierung ist sichtbar auf den Trichter).
7. Wenden Sie ein teilweises Vakuum [Druckdifferenz von 34 bis 51 kPa (Kilopascal)] um die zu untersuchende Probe durch den Filter zu ziehen. Insgesamt ausgesetzt Vollmaterial, darunter Bakterien und verwesenden organischen Stoffen, größer als der Filter bedeuten von 0,45 µm Porengröße des Filters gefangen sind. Kleinere Partikel einschließlich Viren und gelöste Feststoffe wie geringe Mengen an organischer Substanz und Salze, passieren durch die Membran und in die Abfallbehälter Isolierflasche mit Bleichmittel.
8. Spülen Sie nach kompletten Durchgang der Probe durch den Filter das Innere des Trichters mit zwei bis drei 20-30 mL sterilem Wasser.
9. Schalten Sie das Vakuum und entfernen Sie den Trichter aus den Krümmer bei Abschluss des abschließenden Spülen.
10. Entfernen Sie mit Ethanol-Flamme sterilisierte Pinzette Membranfilter sofort aus dem Gerät und sofort auf die entsprechende Agarose Wachstumsmedium für die Ziel-Mikroorganismus (in Tabelle 1 sind die empfohlenen Medien und Inkubation Wachstumsbedingungen für jeden).
11. Gelten Sie die Membranfilter für die Agarose-Oberfläche mit einer Roll-Art-Bewegung zu kompletten Kontakt der Membran mit dem Nährmedium zu gewährleisten und um den Einschluss von Luftblasen zu vermeiden.
12. Ersetzen des verwendeten Filtration Trichters mit einer sterilen Einheit zwischen der Verarbeitung jeder einzelnen Probe und Ethanol-desinfizieren Sie die Edelstahl-Krümmer um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

(2) Kolonie Enumeration

1. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit die Wachstumsfugen aus dem Inkubator für die Aufzählung.
2. Idealerweise führen Sie die Kolonie zählt unter low-Power-Vergrößerung mit einer kühlen, weißen Lichtquelle.
3. Insgesamt coliformen
   1. Insgesamt coliforme Kolonien sind in der Regel rosa bis dunkelrot in der Farbe mit einem metallischen Oberflächenglanz. Der Glanz selbst kann die Kolonie ganz oder teilweise abdecken. Atypische insgesamt Coliformen Kolonie Morphologien möglicherweise dunkelrot, schleimigen oder kernhaltigen ohne Glanz.
   2. Kolonien, die rosa, blau, weiß oder farblos beim ermangeln Glanz gelten als nicht-Coliformen.
4. Fäkalen coliformen
   1. Fäkale coliforme Kolonien erscheinen verschiedene Schattierungen von blau.
   2. Nonfecal coliforme Kolonien sind grau bis Creme in der Farbe.
5. Fäkale Enterokokken
   1. Fäkale Enterokokken Kolonien reichen von rosa bis dunkelrot in der Farbe.

(3) Kolonie Überprüfung

1. Insgesamt coliformen
   1. Wischen Sie für eine Überprüfung der Anwesenheit-Abwesenheit die gesamte Membran mit einer sterilen Impfkeimen Schleife. Für Kolonien empfiehlt es sich, mindestens je fünf typischen und atypischen Morphologien zu überprüfen.
   2. Übertragen Sie die ausgewählten Kolonie in ein Glasgefäß mit Natriumlaurylsulfat Tryptose Brühe mit einem Durham Schlauch. Inkubieren Sie die beimpften Röhrchen bei 35±0.5 ° C für 48 h. Das Vorhandensein von Trübung zeigt Wachstum in Verbindung mit Gas-Produktion wird die Kolonie als eine Coliform überprüft.
2. Fäkalen coliformen
   1. Übertragen Sie Kolonien in der Farbe Blau in Glasgefäße mit sterilen EG-Medium mit einem Schlauch Durham aseptisch. Inkubieren Sie die beimpften Röhrchen bei 44,5 ± 0,2 ° C für 24 h. Das Vorhandensein von Trübung zeigt Wachstum in Verbindung mit Gas-Produktion wird die Kolonie als eine fäkale Coliform überprüft.
3. Fäkale Enterokokken
   1. Streik der Kolonien Typisierung fäkale Enterokokken Morphologie für die Isolierung aseptisch auf Gehirn-Herz Infusion Agar (BHIA) und inkubieren Sie bei 35 ± 0,5 ° C für 24 bis 48 h.
   2. Übertragen Sie Wachstum aus einer isolierten Kolonie auf BHIA auf zwei vorgereinigten Objektträger.
   3. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen von 3 % Wasserstoffperoxid hinzu bereit Abstriche auf den Folien. Das schnelle erscheinen der Bläschen zeigt ein Ergebnis "Katalase positiv", und die Isolierung ist keine fäkale Streptokokken-Bakterien.
   4. Führen Sie eine Gram-Färbung Isolate testen als "Katalase negativ" (keine Bläschen beobachtet). Fäkale Enterokokken sind gram-positive, eiförmig und erscheinen meist in Paaren oder kurzen Ketten.

Tabelle 1. Häufig verwendete Wachstum Nährmedien für die Erkennung von fäkalen Bakterien Indikatoren in Umweltproben
¹ Empfehlung der Standardmethoden für die Prüfung von Wasser und Abwasser (American Public Health Asssociation und American Water Works Association, 22^Nd Edition, 2012)

Membranfiltration wird in Virus-Abscheidung und Konzentration von Wasser verwendet. Menschliche pathogene Viren tragen eine negative Nettoladung in aquatischen Lösungen und sind häufig auf einem niedrigen Niveau in Wasserquellen. Daher müssen sie vor der Analyse konzentriert werden. Membranfiltration ist aber ein Capture-Methode für diesen Zweck und beschäftigt einen negativ geladenen Filter. Wasserproben (z. B. 1-L) von Interesse mit einer Salzlösung geändert werden (zB. Magnesiumchlorid) vermitteln eine positive Ladung, die Viren, die Adsorption an den negativ geladenen HA Membranfilter dadurch zu erleichtern, da das Wasser gefiltert wird. Eine niedrige Konzentration saure Lösung dient zum Spülen der Membran und loszuwerden überschüssige Salze. Eine niedrige Konzentration und Volumen der Natronlauge wird dann verwendet, um die Viren aus dem Filter vor weitere Konzentrationen und Analysen (z.B. Zelle Kultur Infektiosität Assays oder quantitative PCR) freizugeben.

Membranfiltration wird auch bei der Herstellung von hochreinem Wasser für den industriellen Einsatz genutzt. Viele Branchen erfordern hoch gereinigtes Wasser für ihre betrieblichen Abläufe. Membranfiltration (z.B. Nano-Filtration) dient dazu, die Verunreinigungen einschließlich der gelösten Metalle zu entfernen und Salze aus dem Wasser. Membranfiltration dient auch in der Entsalzung von Meerwasser um zu Trinkwasser zu produzieren.