Análisis de la curva de crecimiento bacteriano y sus aplicaciones ambientales

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner

Las bacterias se encuentran entre las más abundantes formas de vida en la tierra. Se encuentran en cada ecosistema y son vitales para la vida diaria. Por ejemplo, afectan las bacterias lo que come, beber y respirar, y hay células bacterianas más dentro de un cuerpo de células de mamíferos. Debido a la importancia de las bacterias, es preferible estudiar una especie particular de bacterias en el laboratorio. Para ello, las bacterias se cultivan bajo condiciones controladas en cultivo puro, lo que significa que sólo un tipo de bacteria está bajo consideración. Las bacterias crecen rápidamente en cultivo puro, y número de células aumenta dramáticamente en un corto periodo de tiempo. Midiendo la tasa de población de la célula aumentan con el tiempo, una "curva de crecimiento" a desarrollarse. Esto es importante cuando se pretende utilizar o inocular a un número conocido de la cepa bacteriana, por ejemplo, para mejorar el crecimiento de las plantas, incrementar la biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos o producir antibióticos u otros productos naturales a una escala industrial.

Reproducción bacteriana se produce por fisión binaria, en la que una célula bacteriana se divide y se convierte en dos células (figura 1). El tiempo necesario para la división celular se conoce como la generación de medio tiempo o tiempo de duplicación, que es el tiempo necesario para el número de células a doble.

Figura 1. Exponencial la división celular. Cada división celular produce una duplicación del número de células. En un número bajo de células, el aumento no es muy grande; sin embargo después de algunas generaciones, celular números aumento explosivo. Después de números divisiones, hay 2ⁿ células.

Para entender y definir el crecimiento de microorganismos particulares, se colocan en un matraz, donde se controlan el suministro de nutrientes y condiciones ambientales. Si el medio líquido proporciona todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y parámetros ambientales propicios para el crecimiento, el aumento de números puede medirse como una función del tiempo para obtener una curva de crecimiento. Se observan varias fases de crecimiento distintas dentro de una curva de crecimiento (figura 2). Se trata de la fase lag, la exponencial o fase logarítmica, fase estacionaria y la fase de muerte, cada uno de los cuales se asocian con cambios fisiológicos específicos (tabla 1).

Fase	Características
Fase lag	Crecimiento lento o falta de crecimiento debido a la adaptación fisiológica de las células a condiciones de cultivo o dilución de exoenzimas debido a la densidad celular inicial de baja.
Exponencial o fase	Tasas de crecimiento óptimo, durante que números de celular doble en intervalos de tiempo discretos conocidos como el tiempo de generación malo.
Fase estacionaria	Crecimiento (división celular) y la muerte de las células de contrapeso entre sí dando por resultado ningún aumento neto en número de células. La tasa de crecimiento reducida es generalmente debido a una falta de nutrientes o acumulación de constituyentes de residuos tóxicos.
Fase de muerte	Tasa de mortalidad supera la tasa de crecimiento lo que resulta en una pérdida neta de células viables.

Tabla 1. Las cuatro fases del crecimiento bacteriano.

Figura 2. Una curva de crecimiento típica de una población bacteriana. Comparar la forma de las curvas basado en formadoras de colonias (UFC) de unidades versus densidad óptica, particularmente en la fase de muerte. La diferencia es debido a que las células muertas todavía resultado de turbiedad, pero no forman colonias viables en la cultura.

En general, es a menudo crítico para determinar la cinética de crecimiento bacteriano de un aislado bacteriano determinado, con el fin de conocer el número de células bacterianas presentes en el medio líquido. Hay diferentes maneras de medir el crecimiento en un medio líquido, incluyendo mediciones de turbidez con un espectrofotómetro colorimétrico y galjanoplastia de dilución seriada. Mediciones de turbidez se basan en el hecho de que las células más presentan en el medio líquido, el más turbio que el líquido se convierte. Placas de dilución seriada implica ensayo el número de células en el medio líquido que puede formar colonias viables de sólida cultura, una medida conocida como "unidades formadoras de colonias" de la cultura. Observe, sin embargo, que tales ensayos de placas pueden utilizarse para las bacterias que son, de hecho, cultivable.

1. colección de alícuotas de cultivo bacteriano

1. Un día antes de la colección de puntos de tiempo de crecimiento, sembrar 20 mL de medio de caldo (TSB) de soya tripticasa en un matraz de 50 mL con e. coli.
2. Incubar durante una noche a 27 º C. Este período de incubación relativamente largo resulta en una población de fase estacionaria del tipo salvaje de e. coli de aproximadamente 10⁹ UFC/mL.
3. Al día siguiente, utilice 100 μl de la cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (en un matraz de 500 mL). Mezclar bien.  Sacar una alícuota de 5 mL y refrigere inmediatamente a 4 ° C. Esto es T = 0 o punto del tiempo T₀ y debe contener aproximadamente 4 x 10⁵ UFC/mL.
4. Colocar el matraz de la restante e. coli (245 mL) en un 37 º C agitando la incubadora. Retirar alícuotas de 5 mL de cultura cada hora, hasta 8 h. almacenar cada alícuota a 4 ° C. Designar estas alícuotas T₁ a T₈.

2. serie dilución

1. Extraer alícuotas de e. coli el refrigerador y el lugar en el hielo para el transporte. No todas las culturas en hielo hasta su uso.
2. Establecer una serie de tubos de dilución para obtener varias diluciones de cada cultura de e. coli (figura 3). Los tubos del microfuge son convenientes para esta función. Cada tubo de dilución debe tener 900 μl de líquido de dilución (solución salina estéril). Se necesita una serie de diluciones para cada cultivo de e. coli (T₀ al T₈); etiquetar cada tubo según la tabla 2.
   
   Figura 3. Diagrama esquemático mostrando el procedimiento para la e. colide la galjanoplastia.
3. Comienzan las diluciones añadiendo 100 μl de e. coli del tubo con la etiqueta T₀ (la inicial cultura de e. coli ) al tubo A, que es la dilución 10^-1 T₀. Vórtice el tubo durante 5 s.
4. Posteriormente, añada 100 μl del tubo al siguiente tubo de solución salina, tubo B, que es la dilución 10^-2 T₀. Seguir con la serie de la dilución necesaria para cada alícuota de punto de tiempo. Recuerde vortex cada antes del tubo de transferencia. También es importante utilizar una punta de pipeta nueva para cada transferencia.

Cultura de e. coli	Las diluciones necesitan y tubo #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tabla 2. Serie de diluciones requerida para cada cultivo de e. coli .

3. galjanoplastia

1. Tres diluciones de cada alícuota de punto de tiempo de cultura de e. coli serán plateadas, según tabla 3. Etiqueta de las placas con el punto del tiempo (T₁ a T₈), el factor de dilución y el volumen a añadir. Usar las placas por triplicado para cada dilución.
2. Añadir 100 μl de cada dilución en la placa transfiriendo la cantidad al centro de la placa de agar (figura 3). Inmediatamente extendió la alícuota utilizando una llama esterilizado "L" en forma de varilla de vidrio. Si la alícuota no se difunde inmediatamente, sorbs en situ en la placa, dando lugar a crecimiento excesivo bacteriano en el lugar de la inoculación inicial.
3. Repita la chapa para cada serie de dilución tiempo puntos T₁ a T₈. No olvide esterilizar la varilla entre las placas y sobre todo entre diferentes diluciones.
4. Una vez que las placas se han secado durante unos minutos, invertir y colocar en incubadora de 37 ° C durante la noche. Invertir las placas impedir la condensación caigan sobre la placa de agar. Después de incubación durante la noche, las placas deben guardarse en el refrigerador.

E. coli cultura	Diluciones a platear
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7 *	10-5	10-6	10-7
T8 *	10-4	10-5	10-6

^* Diluciones más bajas tienen en cuenta poblaciones inferiores debido a la fase de muerte.

Tabla 3. Protocolo para cultivos de e. coli de la galjanoplastia.

4. recuento de colonias y calcular el tiempo de generación malo

1. Examinar las placas para la uniformidad de las colonias y la falta de contaminación.
2. Para cada punto del tiempo (T₀ al T₈), escoge una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias y cuenta por triplicado.
3. El factor de dilución, back-calcular el número de células por mL del cultivo original en tiempo puntos T₀ al T₈. Por ejemplo, si el número de colonias resultantes de la dilución 10^-4 es de 30, 28 y 32:
   Significa el número de colonias = 30 colonias
   Estos surgieron de 0,1 mL de una dilución de 10^-4
   Número de colonias por mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Diagrama log₁₀ UFC/mL frente al tiempo (en horas).
5. De la gráfica, determinar la fase exponencial de crecimiento. 2 puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial y los correspondientes números de celular en cada momento, calcular el tiempo de generación malo.

Después de una dilución seriada de la galjanoplastia experimento, se obtuvieron los siguientes datos. Al principio del crecimiento exponencial señalado aquí como el tiempo t = 0, la concentración inicial de células bacterianas es 1.000 ufc/mL. En el tiempo t = 6 h, la concentración de células es de 16.000 ufc/mL.

Ahora, X = 2ⁿ x X₀

Donde: X₀ = concentración inicial de células = 1.000 ufc/mL
X = concentración de células después de tiempo t = 16.000 ufc/mL
n = número de generaciones
16.000 = 2ⁿ x 1,000
2ⁿ = 16
sesión₁₀ 2ⁿ = log₁₀ 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301

Cuatro generaciones transcurrido en 6 h, así que

Tiempo de generación medio = 6/4 = 1.5 h.

Figura 4. Un nódulo de la raíz que contiene bacterias fijadoras de nitrógeno.

Conocimiento de números bacteriano y cinética de crecimiento bacteriano en un medio de cultivo es importante de una investigación y el punto de vista comercial. En la investigación, a menudo es fundamental para conocer el número de bacterias en una muestra, por lo que el experimento puede repetirse, si fuera necesario, con los mismos números exactos. Por ejemplo, durante los experimentos en que se agregan inoculantes bacterianos a una parcela de tierra, un mínimo de 10⁴ UFC deben añadirse por gramo de suelo para conseguir el efecto deseado, como mayor biodegradación de contaminantes tóxicos de suelo orgánico. Otro ejemplo es el caso de inoculantes rizobios producidos comercialmente, donde el conocido número de rizobios (bacterias que entran en relaciones simbióticas con las raíces de las plantas) está impregnado en un medio a base de turba de carbón (figura 4). El medio se utiliza para inocular semillas de leguminosas para mejorar la fijación biológica del nitrógeno (es decir, la conversión de nitrógeno molecular en formas orgánicas que puede ser utilizado por organismos como nutrientes).

Cinética de crecimiento también es útil para evaluar si particular cepas de bacterias están adaptadas para metabolizar ciertos sustratos, como desechos industriales o contaminación de aceite. Las bacterias que están genéticamente diseñadas para limpiar derrames de petróleo, por ejemplo, se pueden cultivar en presencia de complejos hidrocarburos para asegurar que su crecimiento no sería ser reprimido por los efectos tóxicos del petróleo. Del mismo modo, la pendiente y la forma de las curvas de crecimiento producido a partir de bacterias cultivadas con mezclas de residuos industriales pueden informar a los científicos si las bacterias pueden metabolizar la sustancia particular, y cuántas fuentes de energía potencial para las bacterias que pueden encontrarse en la mezcla de residuos.