Análise da Curva de Crescimento Bacteriano e suas Aplicações Ambientais

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner

As bactérias estão entre as formas de vida mais abundantes na Terra. Eles são encontrados em todos os ecossistemas e são vitais para a vida cotidiana. Por exemplo, as bactérias afetam o que as pessoas comem, bebem e respiram, e na verdade há mais células bacterianas dentro do corpo de uma pessoa do que células de mamíferos. Devido à importância das bactérias, é preferível estudar determinadas espécies de bactérias em laboratório. Para isso, as bactérias são cultivadas sob condições controladas em cultura pura, o que significa que apenas um tipo de bactéria está em consideração. As bactérias crescem rapidamente na cultura pura, e o número de células aumenta drasticamente em um curto período de tempo. Medindo a taxa de aumento da população celular ao longo do tempo, uma "curva de crescimento" a ser desenvolvida. Isso é importante quando se pretende utilizar ou vacinar números conhecidos do isolado bacteriano, por exemplo, para melhorar o crescimento das plantas, aumentar a biodegradação de orgânicos tóxicos, ou produzir antibióticos ou outros produtos naturais em escala industrial.

A reprodução bacteriana ocorre por meio de fissão binária, na qual uma célula bacteriana se divide e se torna duas células(Figura 1). O tempo necessário para a divisão celular é conhecido como o tempo médio de geração, ou o tempo de duplicação, que é o tempo necessário para o número de células dobrar.

Figura 1. Divisão celular exponencial. Cada divisão celular resulta em uma duplicação do número da célula. Em números de células baixas, o aumento não é muito grande; no entanto, após algumas gerações, o número de células aumenta explosivamente. Depois das divisões, há células 2^n.

Para entender e definir o crescimento de microrganismos particulares, eles são colocados em um frasco, onde o fornecimento de nutrientes e as condições ambientais são controlados. Se o meio líquido fornece todos os nutrientes necessários para o crescimento e parâmetros ambientais propícios ao crescimento, o aumento do número pode ser medido em função do tempo para obter uma curva de crescimento. Várias fases distintas de crescimento podem ser observadas dentro de uma curva de crescimento(Figura 2). Estes incluem a fase de defasagem, a fase exponencial ou de registro, a fase estacionária e a fase de morte, cada uma delas associada a alterações fisiológicas específicas(Tabela 1).

Mesa 1. As quatro fases do crescimento bacteriano.

Figura 2. Uma curva típica de crescimento para uma população bacteriana. Compare a forma das curvas com base em unidades formadoras de colônias (UFC) versus densidade óptica, particularmente na fase de morte. A diferença se deve ao fato de que as células mortas ainda resultam em turbidez, mas não podem formar colônias viáveis na cultura.

No geral, muitas vezes é fundamental determinar a cinética de crescimento bacteriano para um determinado isolado bacteriano, a fim de saber o número de células bacterianas presentes no meio líquido. Existem diferentes maneiras de medir o crescimento em um meio líquido, incluindo medidas de turbidez usando um espectotômetro colorimétrico e revestimento de diluição serial. As medidas de turbidez dependem do fato de que quanto mais células presentes no meio líquido, mais turvo o líquido se torna. O revestimento de diluição serial envolve o ensaio do número de células no meio líquido que podem formar colônias viáveis sobre cultura sólida, uma medida conhecida como "unidades formadoras de colônias" da cultura. Note- se, no entanto, que tais ensaios de revestimento só podem ser usados para bactérias que são, de fato, culturable.

1. Coleção de Alíquotas de Cultura Bacteriana

1. Um dia antes da coleta de pontos de tempo de crescimento, inocular 20 mL de caldo de soja tripática (TSB) médio em um frasco de 50 mL com E. coli.
2. Incubar durante a noite a 27 °C. Este período de incubação relativamente longo resulta em uma população de fase estacionária de tipo selvagem E. coli de aproximadamente 1099 CFU/mL.
3. No dia seguinte, use 100 μL da cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (em um frasco de 500 mL). Homogeneizar.  Remova uma alíquota de 5 mL e leve à geladeira imediatamente a 4 °C. Este é t = 0 ou T₀ ponto de tempo, e deve conter aproximadamente 4 x 10⁵ CFU/mL.
4. Coloque o frasco do E. coli restante (245 mL) em uma incubadora de agitação de 37 °C. Remova alíquotas de cultura de 5 mL a cada hora, até 8h. Armazene cada alíquota a 4 °C. Designe essas alíquotas T₁ a T₈.

2. Diluição seriada

1. Remova as alíquotas de E. coli da geladeira e coloque no gelo para o transporte. Mantenha todas as culturas no gelo até o uso.
2. Configure uma série de tubos de diluição para obter várias diluições de cada cultura E. coli (Figura 3). Tubos de microfuge são convenientes para esta função. Cada tubo de diluição deve ter 900 μL de fluido de diluição (soro fisiológico estéril). Uma série de diluição é necessária para cada cultura E. coli (T₀ a T₈); rotular cada tubo de acordo com a Tabela 2.
   
   Figura 3. Esquema mostrando o procedimento para chapeamento E. coli.
3. Inicie as diluições adicionando 100 μL de E. coli do tubo rotulado T₀ (a cultura inicial E. coli) ao tubo A, que é a diluição de^{10 -1} de T₀. Vórtice o tubo para 5 s.
4. Posteriormente, adicione 100 μL de tubo A ao próximo tubo de soro fisiológico, tubo B, que é a diluição de 10^-2 de T₀. Continue a série de diluição necessária para cada alíquota de ponto de tempo. Lembre-se de vórtice de cada tubo antes da transferência. Também é importante usar uma nova dica de pipeta para cada transferência.

Mesa 2. Série de diluição necessária para cada cultura E. coli.

3. Chapeamento

1. Três diluições para cada alíquota de ponto de cultura E. coli serão emplacados, de acordo com a Tabela 3. Placas de etiqueta com o ponto de tempo (T₁ a T₈), o fator de diluição e volume a ser adicionado. Use placas triplicadas para cada diluição.
2. Adicione 100 μL de cada diluição à placa, canalizar a quantidade para o centro da placa deágar (Figura 3). Espalhe imediatamente a alíquota utilizando uma haste de vidro em forma de "L" esterilizada por uma chama. Se a alíquota não for espalhada imediatamente, ela se torna in situ na placa, resultando em crescimento excessivo bacteriano no local da inoculação inicial.
3. Repita o revestimento para cada série de diluição para os pontos de tempo T₁ a T₈. Lembre-se de esterilizar a haste entre as placas e especialmente entre diferentes diluições.
4. Uma vez que as placas tenham secado por alguns minutos, inverta e coloque em incubadora de 37 °C durante a noite. Inverter as placas impede a condensação de cair sobre a placa de ágar. Após a incubação durante a noite, as placas devem ser armazenadas na geladeira.

^* Diluições mais baixas levam em conta populações mais baixas devido à fase de morte.

Mesa 3. Protocolo de chapeamento para culturas E. coli.

4. Contando colônias e calculando o tempo médio de geração

1. Examine as placas para uniformidade das colônias e falta de contaminação.
2. Para cada ponto de tempo (T₀ a T_8),escolha uma diluição que contenha entre 30 e 300 colônias, e conde placas triplicadas.
3. Utilizando o fator de diluição, calcule de volta o número de células por mL de cultura original nos pontos de tempo T₀ a T₈. Por exemplo, se o número de colônias resultantes de uma diluição de 10^-4 for 30, 28 e 32:
   Número médio de colônias = 30 colônias
   Estes surgiram de 0,1 mL de uma diluição de 10^-4
   Número de colônias por mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Registro de_{parcela 10} CFU/mL versus tempo (em horas).
5. A partir do gráfico, identifique a fase exponencial do crescimento. Usando 2 pontos de tempo dentro da fase de crescimento exponencial e os números de células correspondentes em cada momento, calcule o tempo médio de geração.

Após um experimento de revestimento de diluição serial, os seguintes dados foram obtidos. No início do crescimento exponencial designado aqui como tempo t = 0, a concentração inicial de células bacterianas é de 1.000 UFC/mL. No momento t = 6 h, a concentração de células é de 16.000 UFC/mL.

Agora, X = 2ⁿ x X₀

Onde: X₀ = concentração inicial de células = 1.000 UFC/mL
X = concentração de células após o tempo t = 16.000 UFC/mL
n = número de gerações
16.000 = 2ⁿ x 1.000
2ⁿ = 16
log₁₀ 2ⁿ = log₁₀ 16
n x 0,301 = 1.204
n = 1,204 = 4
0.301

Quatro gerações decorridos em 6 h, então

Tempo médio de geração = 6/4 = 1,5 h.

Figura 4. Um nódulo radicular que contém bactérias fixadoras de nitrogênio.

O conhecimento da cinética de crescimento bacteriano e números bacterianos em um meio de cultura é importante tanto do ponto de vista da pesquisa quanto do ponto de vista comercial. Na pesquisa, muitas vezes é fundamental saber o número de bactérias em uma amostra, para que o experimento possa ser replicado, se necessário, com os mesmos números. Por exemplo, durante experimentos em que inoculantes bacterianos são adicionados a um lote de solo, um mínimo de^{10 4} UFC precisa ser adicionado por grama de solo para obter o efeito desejado, como a biodegradação aprimorada de contaminantes tóxicos do solo orgânico. Outro exemplo é o caso de inoculantes rizobiais produzidos comercialmente, onde números conhecidos de rizobia (bactérias que entram em relações simbióticas com as raízes das plantas) são impregnados em um meio de carbono à base de turfa(Figura 4). O meio é então usado para inocular sementes de leguminosas para melhorar a fixação biológica de nitrogênio (ou seja,a conversão de nitrogênio molecular em formas orgânicas que podem ser usadas por organismos como nutrientes).

A cinética de crescimento também é útil para avaliar se determinadas cepas de bactérias são adaptadas para metabolizar certos substratos, como resíduos industriais ou poluição por óleo. Bactérias geneticamente modificadas para limpar derramamentos de óleo, por exemplo, podem ser cultivadas na presença de hidrocarbonetos complexos para garantir que seu crescimento não seja reprimido pelos efeitos tóxicos do petróleo. Da mesma forma, a inclinação e a forma das curvas de crescimento produzidas a partir de bactérias cultivadas com misturas de resíduos industriais podem informar os cientistas se as bactérias podem metabolizar a substância específica, e quantas fontes potenciais de energia para as bactérias podem ser encontradas na mistura de resíduos.