Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Die Sekretion extrazellulärer Vesikel durch Cestoden ist entscheidend, um die zelluläre Kommunikation nicht nur zwischen Parasiten, sondern auch mit dem Wirtsgewebe zu ermöglichen. Insbesondere kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) fungieren als Nano-Carrier, die natürliche Antigene übertragen, die für die Immunmodulation des Wirts und das Überleben von Parasiten entscheidend sind. In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung von sEVs aus Kulturen von Echinococcus granulosus im Larvenstadium vorgestellt und ihre Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem murinen Knochenmark analysiert, die während ihrer Reifung nach einer Woche In-vitro-Kultur Adhäsions- und Antigenpräsentationskapazität erwerben. Dieser Artikel bietet umfassende Informationen zur Erzeugung, Reinigung und Quantifizierung von sEVs mittels Ultrazentrifugation sowie parallele Analysen der dynamischen Lichtstreuung und der Transmissionselektronenmikroskopie. Darüber hinaus wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Knochenmarkzellen von Mäusen und deren Differenzierung in dendritische Zellen mit Hilfe von Flt3L skizziert. Diese dendritischen Zellen können naiven T-Zellen Antigene präsentieren und so die Art der Immunantwort in vivo modulieren. Daher werden alternative Protokolle, einschließlich konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie, vorgeschlagen, um den erworbenen Reifungsphänotyp von dendritischen Zellen zu überprüfen, die zuvor parasitären sEVs ausgesetzt waren. Schließlich ist es erwähnenswert, dass das beschriebene Protokoll als Ganzes oder in einzelnen Teilen angewendet werden kann, um Parasiten-In-vitro-Kulturen durchzuführen, extrazelluläre Vesikel zu isolieren, dendritische Zellkulturen aus dem Knochenmark zu erzeugen und Aufnahmeassays mit diesen Zellen durchzuführen.

Echinococcus granulosus ist ein zoonotischer parasitärer Helminthen, der für eine Langzeitinfektion verantwortlich ist, die als zystische Echinokokkose^{bekannt ist 1}. Bei Zwischenwirten wie Nutztieren und Menschen betrifft die Parasiteninfektion hauptsächlich die Leber und die Lunge, wo sich das Larvenstadium in Form von flüssigkeitsgefüllten Zysten oder Metazestoden entwickelt, die Protoskoleces (selbst eine Larve) enthalten. Wie allen Cestoden fehlt es diesem Parasiten sowohl an Verdauungs- als auch an Ausscheidungssystemen und daher hat er aktive endozytäre und exozytäre zelluläre Prozesse entwickelt, um die Aufnahme und Ausscheidung von Metaboliten sowie die Freisetzung extrazellulärer Vesikel zu regulieren^2,3. Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind von Lipiddoppelschichten umschlossene Partikel, die von scheinbar allen Zelltypen sezerniert werden. Insbesondere kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), definiert als EVs, die kleiner als 200 nm sind, unabhängig von ihrem Biogenese-Ursprung⁴, können als interzelluläre Immunmediatoren wirken. Diese Funktion ist besonders wichtig für Parasiten, die auf die Immunmodulation des Wirts angewiesen sind, um ihr Überleben zu sichern³. Die Immunmanipulation wird durch die Aufnahme von sEVs durch dendritische Zellen des Wirts erreicht, die einzigen Zellen, die in der Lage sind, naive T-Zellen in vivo zu aktivieren und eine adaptive Immunantwort zu initiieren, die zu einer chronischen Infektion durch diese parasitären Würmer führt. Dendritische Zellen, professionelle Antigen-präsentierende Zellen des angeborenen Immunsystems, verarbeiten und laden antigene Peptide auf die Haupthistokompatibilitätskomplexe Klasse I und Klasse II (MHC I und MHC II) und stellen sie auf ihren Membranen für exklusives naives T-Zell-Priming (CD8⁺ bzw. CD4⁺ T-Zellen) aus)⁵. Nachfolgende dendritische Zellen induzieren ihre Reifung durch Induktion der Expression der co-stimulatorischen Marker CD80/CD86 und CD40 und MHC-II und wandern bei Erkennung fremder Antigene aus peripheren Geweben in sekundäre lymphoide Organe, die für exklusives naives T-Zell-Priming geladen^{werden 6}. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht daher darin, die Parasit-Wirt-Kommunikation des Helminthen auf realistische Weise zu untersuchen, indem die Verpackung und Abgabe von parasitären Komponenten in Form von sEVs analysiert wird, die beim Erreichen der Immunzellen des Wirts die Entwicklung der Infektion und das Fortschreiten der chronischen parasitären Erkrankung beeinflussen.

Die Analyse der Helminthen-Wirt-Grenzfläche durch die Untersuchung von sEVs hat mehrere Vorteile. Erstens ist das Tegument, die äußere Hülle von Plattwürmern, eine Doppelmembranstruktur, die einen wichtigen Kreuzungspunkt zwischen dem Parasiten und seinem Wirt darstellt und es ermöglicht, dass sEVs leicht aus dieser Struktur erzeugt oder durchdrungen werden^{können 7}. Zweitens sind sEVs hochgradig mit Proteinantigenen aus allen Stadien des Parasitenlebenszyklus beladen, was die natürliche Art und Weise darstellt, auf der das Immunsystem des Wirts während einer Wurminfektion Antigene probiert ^8,9. Aufgrund ihrer biologischen Produktion, ihrer einfachen Reinigung (ohne Gewebeaufschluss oder Proteinfraktionierung) und ihrer direkten Interaktion mit Wirtszellen ermöglichen Helminthen-sEVs die Entwicklung von In-vitro-Experimenten, um die In-vivo-Bedingungen der Parasit-Wirt-Interaktion zu simulieren. Schließlich stellen sEVs die Möglichkeit dar, parasitäre Strukturen zu haben, die von Wirtszellen phagozytiert oder internalisiert werden können, wodurch die Unmöglichkeit überwunden wird, dies bei ganzen Parasiten zu tun, insbesondere bei enzystierten Würmern.

In Anbetracht der genannten Vorteile und der Tatsache, dass Helminthiasen weit verbreitete und typischerweise chronische Krankheiten sind, bei denen Parasiten vermutlich das Immunsystem des Wirts als Überlebensstrategie manipulieren, bietet die Isolierung von von Parasiten abgeleiteten EVs und ihre Untersuchung in Wechselwirkung mit dendritischen Zellen einen wertvollen Rahmen für die Erforschung dieser Immunmodulation¹⁰. In diesem Sinne wurde beschrieben, dass die Internalisierung von EVs aus Helminthen, einschließlich Nematoden und Platyhelminthen wie Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi und E. granulosus, die Reifung und Aktivierung von dendritischen Zellen induziert 9,11,12,13,14,15.

Die Isolierung von aus Helminthen gewonnenen EVs ermöglicht nicht nur die Untersuchung immunologischer Wechselwirkungen, was möglicherweise zur Entwicklung von schützenden Impfstoffen oder Immuntherapeutika für allergische oder Autoimmunerkrankungen führt, sondern erleichtert auch die Erforschung anderer biologischer Wechselwirkungen und Funktionen ^8,16,17. In diesem Zusammenhang könnten EVs, die in der natürlichen Geschichte parasitärer Infektionen eine Rolle spielen, genutzt werden, um die Entwicklung von Parasiten und Interaktionen mit spezifischen Wirtszellen zu untersuchen. Darüber hinaus könnten sie als frühe oder differentielle Biomarker für die Diagnose parasitärer Erkrankungen, die Überwachung des therapeutischen Ansprechens und den Beitrag zur Kontrolle und Behandlung parasitärer Infektionen haben^17,18.

Darüber hinaus ist, wie bereits gezeigt, das Larvenstadium von E. granulosus anfällig für Veränderungen der zytosolischen Calciumkonzentration, die nicht nur eine Rolle für die Lebensfähigkeit der Parasiten spielen, sondern auch die Exozytoserate steuern^19,20. In diesem Zusammenhang und in dem Wissen, dass eine intrazelluläre Kalziumerhöhung die EV-Freisetzung verbessert, könnte die Verwendung eines intrazellulären Kalziumverstärkers wie Loperamid eine entscheidende Strategie sein, um die Anzahl der EVs zu erhöhen. Dieser Ansatz ist besonders interessant für zelluläre Systeme, die große Populationen benötigen, um eine ausreichende Menge an Elektrofahrzeugen für die Fracht- und Funktionsanalyse zu erzeugen 11,21,22. Das aktuelle Protokoll (Abbildung 1) beschreibt die Methoden zur Gewinnung von Reinkulturen des Larvenstadiums von E. granulosus und die Bedingungen, die die sEV-Produktion verbessern. Es beschreibt auch den Arbeitsablauf für die Isolierung und Charakterisierung dieser Vesikel sowie ihre Aufnahme durch murine dendritische Zellen, ein wesentlicher Schritt in der ersten Studie der Modulation des Immunsystems des Wirts.

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Tierversuchsausschuss der Fakultät für Exakte und Naturwissenschaften in Mar del Plata bewertet und genehmigt (Genehmigungsnummern: RD544-2020; Nr. RD624-625-2021; RD80-2022). In diesem Protokoll wurden Mäuse gemäß dem von den NIH veröffentlichten "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" und den Richtlinien des National Health Service and Food Quality (SENASA) eingeschläfert.

1. Kultivierung der Echinococcus-Larve

HINWEIS: Alle Eingriffe wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.

1. E. granulosus protoscoleces obtention
   1. Mit einer 21-g-Nadel und einer 10-ml-Spritze ist ein Teil der Hydatidenflüssigkeit aus der Lunge oder Leber infizierter Rinder zu aspirieren, um den Zystenturgor zu reduzieren (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Infizierte Lungen und Lebern stammen von Rindern, die im Schlachthof zur routinemäßigen Schlachtung vorgeführt wurden. Sie müssen bei 4 °C gehalten und innerhalb von 24 Stunden nach der Schlachtung verarbeitet werden.
   2. Öffnen Sie die Zyste mit einer Schere und entfernen Sie die laminaren und keimförmigen Schichten mit einer Pinzette aus der Zyste. Legen Sie sie zusammen mit der restlichen Hydatidenflüssigkeit auf eine sterile Petrischale (Abbildung 2B, C).
      HINWEIS: An dieser Stelle wird empfohlen, die Petrischale unter einem inversen Mikroskop zu betrachten, um die Qualität von Protoskoleces und Brutkapseln zu beurteilen. Vermeiden Sie es, das biologische Material aus Zysten zu sammeln, bei denen mehr als 50% der Protoskolen kollabiert sind, die an ihrem zusammengezogenen Soma, ihrer dunkleren Farbe und ihrem desorganisierten Rostellum mit Verlust von Haken zu erkennen sind.
   3. Waschen Sie die Schichten mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit Antibiotika (100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml, Gentamicin 100 μg/ml) ergänzt wird, um die Protoskoleces zu entfernen.
      HINWEIS: Alle Waschungen werden mit PBS durchgeführt, das mit Antibiotika ergänzt wird.
   4. Übertragen Sie die Protoscolex-Suspension mit einer Pasteur-Pipette in ein steriles Khan-Glasröhrchen.
   5. Waschen Sie die Protoskoleces mit zugesetztem PBS bei 4 °C mit einer Pasteur-Pipette, um abgestorbene Parasiten zu entfernen. Suspendieren Sie die Suspension kräftig, um die Brutkapseln zu brechen und die Freisetzung von Protoscolex zu erleichtern. Lassen Sie die Protoskoleces 1–2 Minuten auf dem Boden des Röhrchens absetzen; dann entwerfe den Überstand mit den toten Protoscoleces.
      HINWEIS: Aufgrund eines Dichteunterschieds siedeln sich lebende Protoskolen schneller an als tote Parasiten.
   6. Wiederholen Sie den Waschvorgang, bis alle abgestorbenen und schwimmenden Protoskolen entfernt sind.
      HINWEIS: Die abgestorbenen Parasiten werden entfernt, wenn sich alle mit der gleichen Geschwindigkeit absetzen.
   7. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit von Protoskolen mit dem Methylen-Ausschlusstest.
      1. Die gewaschenen Protoskoleces mit einer Pipette wieder aufhängen und einen Tropfen auf einen Objektträger geben. Geben Sie einen Tropfen 0,1 mg/ml Methylenblau hinzu und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Warten Sie 2–3 Minuten und beobachten Sie unter dem Mikroskop.
      2. Zählen Sie die Gesamtzahl der lebenden (ungefärbten) und toten (blau gefärbten) Protoskoleces und berechnen Sie den Prozentsatz der lebensfähigen Protoskoleces (Abbildung 2D und Einschub).
         HINWEIS: Die Lebensfähigkeit von Protoscoleces sollte vor der Etablierung der Kulturen bei etwa 98 % liegen. Die Färbezeit sollte 10 Minuten nicht überschreiten, da längere Zeiträume zur Verfärbung lebender Parasiten führen können.
2. E. granulosus Metacestoden Obtention
   1. Erzeugen Sie eine experimentelle sekundäre Hydatidenerkrankung durch intraperitoneale Infektion weiblicher CF1-Mäuse (Körpergewicht 25 ± 5 g) mit 1500 Protoskoleces (entspricht 10 μl des protocolex-Pellets), suspendiert in 0,5 ml supplementiertem PBS (Abbildung 2E).
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Protoskoleces in PBS mit Antibiotika ergänzt bei 4 °C für 24 h oder in Kultur für 3–5 Tage vor der Infektion zu halten.
   2. Metazestoden entwickeln sich innerhalb von 4-6 Monaten nach der Infektion (Abbildung 2F). Während dieser Zeit sind die Tiere unter kontrollierten Laborbedingungen unterzubringen (Temperatur 20 ± 1 °C, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus und Wasser und Futter ad libitum zur Verfügung gestellt). Sobald sich die Zysten entwickelt haben, betäuben Sie die Mäuse mit Ketamin-Xylazin (50 mg/kg/Maus-5 mg/kg/Maus) und euthanasieren Sie sie durch Zervixluxation.
   3. Reinigen Sie die ventrale Oberfläche der Maus mit 70% Alkohol und öffnen Sie chirurgisch die Bauchhöhle, um die entwickelten Metazestoden mit Schere und Pinzette zu entfernen.
   4. Übertragen Sie die Metazestodenmassen in eine sterile Petrischale.
      HINWEIS: Die Metazestodenmassen bestehen aus mehreren inneren Zysten, die von Bindegewebe umgeben sind.
   5. Lösen Sie die Zysten von den Metazestodenmassen, indem Sie das Bindegewebe, das die Metazestoden bedeckt, bei Bedarf vorsichtig mit einer Pinzette entfernen.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass die Parasiten frei von Wirtsgewebe sind.
   6. Waschen Sie die erhaltenen Metazestoden mit supplementiertem PBS bei 4 °C (Abbildung 2G).
3. Kultivierung von E. granulosus protoscoleces und Metacestoden
   1. Bereiten Sie das Nährmedium wie folgt vor: Fügen Sie 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Gentamicin, 4 mg/ml Glukose, 50 mM Hepespuffer pH 7,5 und Medium 199 hinzu, um das gewünschte Endvolumen zu erreichen, und mischen Sie es vorsichtig durch Inversion.
   2. Übertragen Sie 5 ml des vorbereiteten Kulturmediums in jedes Leighton-Röhrchen (Abbildung 2H–I).
   3. Geben Sie die Parasiten in das Nährmedium und inkubieren Sie 5 Tage lang bei 37 °C, ohne das Medium zu wechseln. Inkubieren Sie die Leighton-Röhrchen in einem Winkel von 15°, um eine gleichmäßige Verteilung des biologischen Materials auf der ebenen Oberfläche zu gewährleisten. Dadurch wird die Exposition von Parasiten gegenüber dem Kulturmedium maximiert und gleichzeitig der Kontakt mit dem Gummistopfen verhindert.
      HINWEIS: Fügen Sie 9.000–10.000 Protoskoleces oder 50 Metazestoden hinzu (mit Durchmessern zwischen 5 mm und 15 mm, verteilt als 10 Zysten pro Röhrchen).
   4. Optional können Sie 20 μM Loperamid (eine subletale Konzentration), die 16–24 h lang in Dimethylsulfoxid gelöst sind, in das Parasitenkulturmedium geben, um den zytosolischen Calciumspiegel zu erhöhen und die EV-Freisetzung im Larvenstadium von E. granulosus zu verbessern.
      HINWEIS: Angesichts der Tatsache, dass ein Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentrationen die EV-Produktion erhöht, erhöht die Behandlung des Parasiten mit Verbindungen, die die Kalziumhomöostase beeinflussen, die EV-Freisetzung.

2. Reinigung der extrazellulären Vesikel

1. Sammeln Sie das Parasitenkulturmedium aus jedem Leighton-Röhrchen und überführen Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Das Kulturmedium kann vor der ersten Zentrifugation 24 Stunden lang gelagert werden, ohne dass die Konzentration oder Größenverteilung der Vesikel nur minimal beeinflusst wird. Protoscoleces können dreimal mit PBS-Puffer gewaschen, geerntet und bei -20 °C in 1,5-ml-Röhrchen gelagert werden.
2. Bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen überführen.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden tote Protoskoleces entfernt. Nach jedem Zentrifugationsschritt ist darauf zu achten, dass mindestens 0,5 cm Überstand über dem Pellet verbleiben, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C und überführen Sie ihn mit einer Pipette in neue 1,5 mL Röhrchen.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden größere Zellreste entfernt.
4. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um kleinere Zelltrümmer zu entfernen.
5. Den Überstand mit einer Pipette in ein für den Ultrazentrifugenrotor geeignetes Röhrchen umfüllen. Markieren Sie eine Seite jedes Röhrchens mit einem Marker, bevor Sie es in den Ultrazentrifugenrotor einsetzen. Setzen Sie dann das Rohr mit der markierten Seite nach oben in den Rotor ein.
   HINWEIS: Die Markierung dient als Referenzpunkt für die Positionierung des Pellets nach der Ultrazentrifugation. Die Rohre müssen zu drei Vierteln gefüllt und genau ausbalanciert sein. Fügen Sie daher bei Bedarf PBS hinzu. Überschreitet das Überstandsvolumen die Kapazität eines einzelnen Röhrchens, so werden die Proben in mehrere Röhrchen aufgeteilt und während der Resuspension kombiniert.
6. Bei 100.000 x g 1 h bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand in einer schnellen Aktion abgießen. Lassen Sie die Tube 1 Minute auf dem Kopf stehen. Das Pellet ist zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nicht sichtbar.
   HINWEIS: Der k-Faktor für den verwendeten Rotor beträgt 103.
7. Waschen Sie das Pellet mit mindestens 3 ml PBS, um kontaminierende Proteine zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet erneut, indem Sie mehrmals von der Oberseite des Röhrchens nach unten auf allen Rohrflächen auf und ab pipettieren, hauptsächlich jedoch auf der markierten Seite, auf der das Pellet erwartet wird.
   HINWEIS: Falls zutreffend, das resuspendierte Pellet aus demselben Überstand in einem einzigen Rohr zusammenfassen.
8. Bei 100.000 x g 1 h bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand in einer schnellen Aktion abgießen. Lassen Sie die Tube 1 Minute auf dem Kopf stehen.
   HINWEIS: Der k-Faktor für den verwendeten Rotor beträgt 103.
9. Das Pellet wird in 30 μl PBS nach dem in Schritt 2.7 beschriebenen Verfahren resuspendiert.
   HINWEIS: An dieser Stelle wird empfohlen, die Gesamtproteinkonzentration im resuspendierten Pellet zu messen, um die Menge der sezernierten sEVs abzuschätzen. Die Proteinkonzentration kann durch Messung der Extinktion bei 280 nm mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer bestimmt werden.
10. Übertragen Sie die Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen. Frieren Sie die extrazellulären Vesikel bei -80 °C ein.
    HINWEIS: Um die Vesikelintegrität für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten, frieren Sie das resuspendierte Pellet so schnell wie möglich ein und vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen.

3. Charakterisierung der isolierten Vesikel

1. Bestimmung der EV-Größe mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS)
   HINWEIS: Die dynamische Lichtstreuung ist eine zuverlässige und empfindliche Methode zur Bewertung der Größe (basierend auf dem hydrodynamischen Radius, Rh) und Form von Nanopartikeln in komplexen Flüssigkeiten, unabhängig von ihrer Art. DLS- und Zetapotentialmessungen wurden mit einem monochromatischen He-Ne-Laserstrahl bei 633 nm durchgeführt. Ist die Analyse am Tag der Probenahme nicht möglich, können die Proben vor der Lagerung in einem vorgefilterten Puffer eingefroren werden.
   1. Tauen Sie die Proben auf und bewahren Sie sie bis zur Messung auf Eis auf.
      HINWEIS: Das Einfrieren der Proben kann die Partikelverteilung und -integrität von sEVs beeinträchtigen. Vermeiden Sie daher Gefrier- und Auftauzyklen, da diese zu einer Abnahme des LS-Signals mit reduzierten Peakhöhen führen können.
   2. Die wässrigen Proben, die für DLS verwendet werden, werden durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriert.
      HINWEIS: Bei LS-Experimenten ist es wichtig, alle Lösungen, Puffer und wässrigen Proben zu filtern, um große Partikel und Staub zu entfernen, die die Messungen beeinträchtigen können.
   3. Verdünnen Sie die Proben 1:10 bis 1:50 in vorgefiltertem PBS.
   4. Mischen Sie die Proben vor jeder Messung durch sanftes Invertieren, um eine Sedimentation zu vermeiden, da die LS-Intensität aufgrund der längeren Probenverarbeitungszeit abnehmen kann.
   5. Geben Sie 1 ml der Probe in eine saubere Küvette und positionieren Sie die nicht mattierte Seite im Lasergang auf der linken Seite in das Gerät. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie 2–3 Minuten zur Äquilibrierung warten, bevor Sie die Probe messen.
   6. Messen Sie die Größe in Bezug auf den hydrodynamischen Radius (Rh), bevor Sie die Zetapotentialmessung durchführen. Aufzeichnung von Messungen bei einem einzigen Streuwinkel (θ = 90° bis 150°) bei 25 °C ± 1 °C.
   7. Klicken Sie auf Systemsteuerung , um die Messwerte zu überprüfen und die Datenerfassung zu starten .
      HINWEIS: Basierend auf den mittleren Rh-Werten und den bewerteten Größenverteilungen für sEVs sollte ein Peak zwischen 30 nm und 200 nm beobachtet werden (Abbildung 3). Peaks unter 15 nm in Rh werden auf Nukleinsäuren und Proteine in Suspension zurückgeführt. Typischerweise werden Größenverteilungen aus dem mittleren hydrodynamischen Radius berechnet. Es können aber auch der Z-Durchschnitt (mittlere Partikelgröße in der Probe), der Polydispersitätsindex (PDI, der die Größenheterogenität einer Probe bestimmt) und die Winkelabhängigkeit der Streulichtintensität angegeben werden.
2. Bestimmung von Struktur und Partikelgröße mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
   HINWEIS: Führen Sie eine Negativ-Transmissionselektronenmikroskopie durch, um die Größe, Struktur und Reinheit von sEVs zu beurteilen, unter Verwendung eines Standardprotokolls, das Fixierung, Dehydratisierung, Harzeinbettung und Kontrastierung für sEV-Präparationen umfasst.
   1. Tauen Sie die konzentrierten sEV-Proben aus Schritt 2.10 auf und bewahren Sie sie auf Eis auf.
   2. Fixieren Sie sEVs in 1,5-ml-Röhrchen. 5–10 μl 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7) auf ~5 μl des sEV-Probenpellets (erforderliche sEV-Konzentration ≈ 1 x 10⁸–1 x 10^{9 mL-1}) auftragen und 2 h bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: sEVs können vor der Weiterverarbeitung bis zu 1 Woche bei 4 °C in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer gelagert werden. Wenn daher externe technische Dienste für die TEM-Analyse erforderlich sind, senden Sie die fixierten sEV-Proben gekühlt in 1,5-ml-Röhrchen.
   3. 5 μl der resuspendierten Pellets werden auf die 300-Mesh-Formvar-kohlenstoffbeschichteten EM-Kupfergitter abgeschieden. Bereiten Sie zwei oder drei Gitter für jede Probe vor.
   4. Lassen Sie die Probe 20 Minuten lang in einer trockenen Umgebung adsorbieren und entfernen Sie überschüssige Probe mit Filterpapier aus dem Gitter.
   5. Geben Sie 100 μl Tropfen PBS auf ein Blatt Folie. Übertragen Sie die Gitter (mit der adsorbierten Probenseite nach unten) mit einer sauberen Pinzette zum Waschen in die PBS-Tropfen.
   6. Trocknen Sie die gegenüberliegende Seite der adsorbierten Probe und stellen Sie sicher, dass die Probenseite der Gitter während eines der folgenden Schritte nicht trocknet.
      HINWEIS: Für alle folgenden Schritte geben Sie Tropfen mit den Reagenzien auf eine flache Folie und übertragen Sie die Gitter mit einer Pinzette auf die Tropfen.
   7. Übertragen Sie die Gitter für 5 Minuten auf einen 50 μl Tropfen 1 % Glutaraldehyd.
   8. Waschen Sie die Gitter mit einem 100 μl Tropfen destilliertem Wasser und lassen Sie sie 3 min ziehen. Wiederholen Sie dies neunmal für insgesamt zehn Wäschen.
   9. Kontrastieren Sie die Probengitter 1 Minute lang mit einem 50 μl Tropfen 1 % w/v Uranylacetatlösung, pH 7.
   10. Kontrastieren und betten Sie die Gitter in eine Mischung aus 100 μl 4 % Uranylacetat und 900 μl 2 % Methylcellulose ein.
   11. Trocknen Sie die Gitter 5–10 Minuten lang an der Luft, während sie in der Schleife verbleiben, und betrachten Sie sie mit einem Elektronenmikroskop bei 80–100 kV mit einer Auflösung von 0,2 nm und einer Vergrößerung von 100.000x.
   12. Lagern Sie die Gitter für die Langzeitlagerung in trockenen Lagerboxen.

4. Generierung dendritischer Zellen aus dem Knochenmark

HINWEIS: Dieses Verfahren sollte an jungen Mäusen durchgeführt werden, die sich durch robuste hämatopoetische Systeme mit aktiver Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit auszeichnen. Im Gegensatz dazu zeigen ältere Mäuse eine Abnahme der hämatopoetischen Funktion, reduzierte Stammzellreserven, veränderte Nischeninteraktionen und ein stärker entwickeltes Gedächtnisreservoir, das für die langfristige Immunität und Reaktion auf Krankheitserreger oder altersbedingte Veränderungen wie Immunoseneszenz entscheidend ist.

1. Euthanasieren Sie eine 5-8 Wochen alte weibliche CF-1-Maus gemäß den ethischen Richtlinien der Institution, um das Leiden der Tiere zu minimieren.
2. Besprühen Sie die Maus mit Ethanol, bevor Sie sie in eine Gewebekulturhaube legen.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
3. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Präparierbrett. Machen Sie mit einer Pinzette und einer Präparierschere einen vertikalen "T"-Schnitt über der Harnröhre und verlängern Sie ihn horizontal bis zum oberen Ende der unteren Extremitäten, wobei Sie darauf achten, das Bauchfell nicht zu verletzen oder Organe, insbesondere den Darm, zu punktieren.
4. Trennen Sie die Haut entlang beider Hintergliedmaßen, um Beinknochen und Gewebe mit einer Pinzette freizulegen. Entfernen Sie mit den Händen die Haut jedes Beins, drücken Sie vom Knöchel in Richtung Bauch und ziehen Sie die Haut auf die gegenüberliegende Seite. Beide Beine sind dann hautfrei.
   HINWEIS: Entsorgen Sie den Mauskörper im Beutel für Krankheitserregerrückstände.
5. Entfernen Sie mit Schere und Pinzette vorsichtig den Oberschenkelknochen und das Schienbein, um einen Bruch zu vermeiden. Befestigen Sie die Spitze jedes Knochens mit einer Pinzette und schneiden Sie Sehnen, um Muskelfaszien um die Knochen herum zu entfernen. Vollständige Reinigung des Muskelgewebes mit Papierservietten.
6. Wenn jeder Knochen entfernt wird, legen Sie ihn in ein steriles 50-ml-Röhrchen mit 2 ml vollständigem Medium, das mit RPMI-Medium hergestellt wurde, das mit 5 % FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin und 10 μg/ml Gentamicin ergänzt wurde, um Ablagerungen zu entfernen. Anschließend das Nährmedium aspirieren und verwerfen und die Knochen zweimal 5 Minuten lang mit 70 % Ethanol waschen.
7. Übertragen Sie die Knochen in eine sterile Petrischale.
8. Schneiden Sie die beiden Knochenepiphysen mit einer scharfen Präparierschere ab, um Zugang zu den Knochenmarkzellen zu erhalten.
9. Spülen Sie Knochenmarkzellen aus jedem der vier Knochen vorsichtig in eine sterile Petrischale, indem Sie eine 25-g-Nadel verwenden, die an einer 20-ml-Spritze mit vollständigem Medium befestigt ist. Die Knochen werden transparenter, wenn das Knochenmark entnommen wird.
   HINWEIS: Ein Volumen von 20 mL des gesamten Mediums sollte ausreichen, um die Knochenmarkzellen aus den beiden Femuren und Tibias zu eluieren.
10. Homogenisieren Sie das Medium vorsichtig mit dem eluierten Knochenmark, indem Sie pipettieren, um Knochenbindegewebe und Zellklumpen zu entfernen. Übertragen Sie anschließend die Probe in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen und führen Sie die Zellen durch ein steriles 70-μm-Zellsieb aus Polypropylen, um Bindegewebe und Knochenablagerungen zu entfernen.
11. Die Zellen bei 450 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und stellen Sie sicher, dass das Pellet an der Rohrwand haftet.
12. Inkubieren Sie die Zellen 1 Minute lang bei Raumtemperatur (RT) und resuspendieren Sie sie dann in 500 μl Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC). Neutralisieren Sie den Lysepuffer, indem Sie 3 mL vollständiges Medium hinzufügen.
13. Die Zellen bei 450 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 5 ml vollständigem Medium resuspendieren.
14. Führen Sie die Zellsuspension durch ein steriles 70-μm-Polypropylen-Zellsieb in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen, um Zellaggregate aus lysierten Erythrozyten zu entfernen.
15. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
16. Geben Sie 300 ng/ml rekombinanten murinen Fms-verwandten Tyrosinkinase-3-Liganden (Flt3L) in das Kulturmedium.
17. Plattieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml in einer Multiwell-Platte.
18. Inkubieren Sie die Zellen 7 Tage lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen zu schütteln, während sie sich differenzieren und wachsen, um eine spontane Reifung zu verhindern.
19. An Tag 3 entnehmen Sie 1 ml Medium aus jeder Vertiefung (um eine Störung der Zellen zu vermeiden) und ersetzen Sie es durch 1 ml vorgewärmtes frisches vollständiges Medium, das mit 150 ng/ml rekombinantem murinem Flt3L ergänzt wird.

5. Interaktion zwischen dendritischen Zellen aus dem Knochenmark und extrazellulären Vesikeln von E. granulosus

1. Färbung der extrazellulären Vesikelmembran
   1. Tauen Sie die in Schritt 2.10 gelagerten sEVs auf und bewahren Sie sie auf Eis auf.
   2. Resuspendieren Sie 10 μl gereinigte sEV in 10 μl Markierungsvehikel (Verdünnungsmittel C).
   3. Fügen Sie 20 μl 2x PKH26-Farbstofflösung hinzu, um eine Endkonzentration von 2 μM zu erreichen. Mit einer Pipette vorsichtig mischen und 35 Minuten bei 37° C in Dunkelheit inkubieren.
      HINWEIS: Die 2x PKH26-Farbstofflösung (4 μM) muss unmittelbar vor der Färbung hergestellt werden, indem 0,5 μl PKH26 ethanolische Farbstofflösung zu 125 μl Verdünnungsmittel C hinzugefügt werden.
   4. Während der Inkubation alle 3–5 Minuten vorsichtig mischen, um eine homogene Färbung zu gewährleisten.
   5. Fügen Sie 40 μl BSA 1% hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT, um den Färbeprozess zu stoppen.
   6. Waschen Sie die sEVs mit 1 mL PBS und zentrifugieren Sie sie bei 100.000 x g für 1 h bei 4 °C, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
      HINWEIS: Der k-Faktor für den Rotor beträgt 103.
   7. Resuspendieren Sie das Pellet in 90 μl PBS gemäß dem in Schritt 2.7 beschriebenen Protokoll.
2. Stimulation von dendritischen Zellen aus dem murinen Knochenmark mit extrazellulären Vesikeln von E. granulosus
   1. Entnehmen Sie dendritische Zellen (BMDCs) aus dem Knochenmark und übertragen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Vorsichtig handhaben, um eine spontane Zellreifung zu vermeiden.
   2. Zentrifugieren Sie das Medium bei 450 x g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Überstände aus der Zentrifugation auf, um die Zellen in den nachfolgenden Schritten der Durchflusszytometrie-Analyse neu zu beschichten.
   3. Resuspendieren Sie BMDC in 30 μl ungefärbten sEV aus Schritt 2.10 für die durchflusszytometrische Analyse oder in 90 μl PBS-haltigen gefärbten sEV aus Schritt 5.1.7. für die konfokale Mikroskopie. 30 min bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubieren. Mischen Sie die Probe vorsichtig alle 10 min.
      HINWEIS: Um einen effektiven Kontakt zwischen BMDCs und sEVs zu gewährleisten, sollten die ersten 30 Minuten der Inkubation in einem minimalen Volumen mit 1,5-ml-Röhrchen durchgeführt werden.
   4. Für die konfokale Mikroskopie übertragen Sie die Zellen auf ein mit Alcianblau behandeltes Deckglas (12 mm Durchmesser), das in einer 24-Well-Platte platziert wird. Weitere 30 min bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer mit 5 % CO₂ inkubieren.
      HINWEIS: Die Alcian-Blue-Behandlung verleiht dem Deckglas eine positive Ladung, die die Haftung der negativ geladenen Plasmamembranen von BMDCs erleichtert.
      1. Um die Deckgläser vorzubereiten, tauchen Sie sie in einen gefilterten Farbstoff von 1% Alcianblau 8 GX und erhitzen Sie sie 1–2 Minuten lang in der Mikrowelle, ohne zu kochen. Inkubieren Sie sie 10 Minuten lang in der heißen Lösung und schwenken Sie sie alle 2 bis 3 Minuten.
      2. Waschen Sie dann die Deckgläser mit entionisiertem destilliertem Wasser, um überschüssiges Alcianblau zu entfernen, und trocknen Sie sie auf Küchenpapier ab. Zum Schluss autoklavieren Sie die Deckgläser und lagern Sie sie bis zur Verwendung steril.
   5. Für die durchflusszytometrische Analyse werden die BMDCs-sEVs zurück in dieselbe Vertiefung überführt, aus der sie entnommen wurden (siehe Schritt 5.2.1), die reservierten Überstände aus Schritt 5.2.2 hinzufügen und 18 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubieren.
      HINWEIS: Lassen Sie ca. 500 μl Medium in der Vertiefung, um ein Austrocknen der verbleibenden Zellen nach der Entnahme zu verhindern.
   6. Verwenden Sie Positiv- und Negativkontrollen, um die BMDC-Reifung zu beurteilen. Stimulieren Sie die Zellen mit 100 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) für 18 h als Positivkontrolle. Für eine Negativkontrolle der Endozytose inkubieren BMDCs mit sEVs bei 4 °C. Schließen Sie auch eine unstimulierte dendritische Zellkontrolle ein.
3. Konfokalmikroskopie von extrazellulären Vesikeln aus E. granulosus, die von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark eingefangen und internalisiert wurden.
   1. Sobald die in Schritt 5.2.4 beschriebene Inkubationszeit abgeschlossen ist, aspirieren und verwerfen Sie das PBS vom Deckglas.
   2. BMDCs fixieren, indem Sie 100 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) über das Deckglas geben und 10 Minuten bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Volumen die Oberflächenspannung auf dem Deckglas beibehält.
   3. Aspirieren und entsorgen Sie das PFA, waschen Sie dann das Deckglas dreimal mit PBS-BSA 2%.
   4. 100 μl PBS mit Anti-MHC-Antikörper der Klasse II-FITC, verdünnt 1/100, zugeben und 1 h bei RT in Dunkelheit inkubieren.
   5. Aspirieren und verwerfen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie das Deckglas dreimal mit PBS-BSA 2%.
   6. Fügen Sie 100 μl 50 ng/ml DAPI hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Nasskammer, um die Zellkerne gegenzufärben.
   7. Aspirieren und verwerfen Sie die Färbelösung und waschen Sie das Deckglas dreimal mit PBS-BSA 2 %.
   8. Entfernen Sie das Deckglas mit einer gebogenen Pinzette und trocknen Sie es auf einem Papiertuch ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
   9. Befestigen Sie das Deckglas mit der Vorderseite nach unten auf einem Objektträger mit einem Eindeckmedium aus Polyvinylalkohol und Glycerin. 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C im Dunkeln trocknen lassen.
   10. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Objektträger, indem Sie das Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken.
   11. Betrachten Sie die montierten Proben unter einem konfokalen Mikroskop mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv mit einer Anregungs-/Emissionswellenlänge von 485/538 nm für FITC, 358/461 nm für DAPI und 551/567 nm für PKH26.
4. Phänotypische Bewertung von extrazellulären vesikelstimulierten dendritischen Zellen aus dem Knochenmark mittels Durchflusszytometrie
   1. Nach der in Schritt 5.2.5 beschriebenen Inkubationszeit werden BMDCs geerntet, indem das Medium mit einer Pipette mehrmals auf und ab gespült wird.
   2. Sammeln Sie die mediumhaltigen BMDCs und geben Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen.
   3. Zentrifugieren Sie bei 450 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
      HINWEIS: Um die Zytokinsekretion zu analysieren, können Sie optional die Überstände mit einer Pipette entfernen, sie in neue 1,5-ml-Röhrchen überführen und bei -20 °C für weitere ELISA-Tests (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) lagern.
   4. Resuspendieren Sie die BMDCs in 100 μl PBS, die Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Allophycocyanin (APC) oder Phycoerythrin-konjugierte mAbs enthalten, die an CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC Klasse I und MHC Klasse II gerichtet sind, und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
   5. Die BMDCs mit PBS waschen und bei 450 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
   6. BMDCs werden in 500 μl 1 % PFA resuspendiert, um sie zu fixieren, und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Erfassung in einem Durchflusszytometer.

In Abbildung 1 ist ein Flussdiagramm dargestellt, das die wichtigsten Schritte zur Aufrechterhaltung reiner Kulturen des Larvenstadiums von E. granulosus, die Isolierung und Charakterisierung von sEVs und deren Aufnahme durch dendritische Zellen der Maus zusammenfasst. Um eine hohe sEV-Produktion aus E. granulosus-Protoskolen und Metazestoden zu erreichen, wurde eine zuvor im Labor entwickelte in vitro-Kulturmethode eingesetzt, um das Überleben und die metabolische Homöostase des untersuchten Parasiten zu maximieren (Abbildung 2).

Abbildung 1: Überblick über die experimentellen Verfahren zur Gewinnung von E. granulosus sEVs und BMDCs. Schematische Darstellungen, die die Schritte beschreiben, die in diesem Protokoll von der Gewinnung und Kultivierung des Parasitenmaterials (SCHRITT 1), der Isolierung (SCHRITT 2) und der Charakterisierung von Parasiten-EVs (SCHRITT 3) bis zur Erzeugung von BMDCs (SCHRITT 4) und ihrer Interaktion mit E. granulosus sEVs (SCHRITT 5) durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gewinnung von Proben und In-vitro-Kultur von Protoskoleces und Metazestoden von Echinococcus granulosus. (A) Punktion einer pulmonalen Hydatidenzyste von Rindern zur Extraktion der Hydatidenflüssigkeit. (B) Geöffnete Hydatidenzyste mit freiliegender Membran. (C) Hydatidenmembran und ihre hyaline Flüssigkeit mit Brutkapseln und freien Protoskolen, genannt "Hydatidensand". Einschub: Brutkapsel mit Protoscoleces im Inneren mit erhaltener Morphologie. (D) Optische Mikroskopie der vitalen Protoskoleces nach Entfernung der toten Protoscoleces. Stab 200 μm. Einschub: Methylenblau-Färbung von Protoskoleces mit lebenden Protoscoleces (durchscheinend) und toten Protoscoleces (blau gefärbt, mit roten Pfeilspitzen gekennzeichnet). (E) Inokulation von Protoskoleces in die Peritonealhöhle einer CF-1-Maus. (F) Metazestoden in der Bauchhöhle entwickelten sich nach 7-monatiger Inokulation mit Protoskoleces. (G) Zysten, die aus einer Maus isoliert und mit PBS in eine Petrischale gewaschen wurden. (H,I) In-vitro-Behandlung von Metazestoden und Protoskolen in Leighton-Röhrchen mit M199-Medium. (J,K) Optische Mikroskopie eines Metazestoden und eines Protoscolex von E. granulosus. Balken zeigen 50 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Charakterisierung von EVs, die aus dem Larvenstadium von E. granulosus gereinigt wurden, ist in Abbildung 3 dargestellt. Bei den EVs, die nach dem aktuellen Protokoll isoliert wurden, handelte es sich hauptsächlich um sEVs mit Durchmessern von 50 bis 200 nm, die durch DLS bestimmt (Abbildung 3A) und durch MET bestätigt wurden (Abbildung 3B). Die TEM-Analyse zeigte auch, dass die sEVs die typische becherförmige Morphologie von exosomenähnlichen Vesikeln aufwiesen (Abbildung 3B). Darüber hinaus bestätigte die TEM, dass subletale Konzentrationen von Loperamid als EV-Freisetzungsverstärker wirken können, wie ein erhöhter Anteil von sEVs in mit Loperamid behandelten Proben im Vergleich zu Kontrollen zeigt. Ebenso wurde die höhere Häufigkeit von sEVs, die aus Loperamid behandelten Parasiten gewonnen wurden, durch Messungen der Proteinkonzentration weiter unterstützt (11 ± 1,5 μg/μl im Vergleich zu 6 ± 1 μg/μl bei Kontrollen, Abbildung 3C).

Abbildung 3: Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die aus dem Larvenstadium von E. granulosus gereinigt wurden. (A) Diagramm der dynamischen Lichtstreuung (DLS), das die Größenverteilung isolierter EVs aus Kontroll- (Co) und Loperamid (Lp)-behandelten Protoskolen (PTS) darstellt. (B) Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Fotografien von negativ gefärbten EVs, die von Kontroll- (a) oder Loperamid-behandeltem PTS (d) gereinigt wurden. Maßstabsbalken zeigen 50 nm an. Pfeilheds deuten auf reichlich exosomenartige Vesikel mit der typischen becherförmigen Struktur hin. (b-c) und (e-f) entspricht den Amplifikationen von Boxed-Bereichen aus (a) bzw. (d). (C) Proteinkonzentration des Ultrazentrifugationspellets aus sieben unabhängigen Assays. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Das Sternchen weist auf signifikante Unterschiede hin (Kruskal-Wallis mit Dunn's Post-Test, S. < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 veranschaulicht den Verlauf der BMDC-Generierung durch Beobachtungen von Variationen in der Menge und Morphologie von Knochenmarkzellen von der ersten Kulturetablierung bis zur vollständigen Differenzierung. An Tag 0 wurden hämatopoetische Zellen in einem vollständigen Medium mit einer Dichte von 1× 10⁶ Zellen/ml gezüchtet, ergänzt mit 300 ng/ml Flt3L, einem Zytokin und Wachstumsfaktor, der hämatopoetische Vorläuferzellen aktiviert, um sich zu vermehren und in die dendritische Zellmorphologie zu differenzieren. An den Tagen 1–2 waren die Zellen noch klein und rundlich in der Form ohne signifikante morphologische Veränderungen, obwohl ihre Anzahl zugenommen hatte. Zwischen den Tagen 3 und 5 kam es zu einem aktiven Umbau des Zytoskeletts, der zu heterogenen, länglichen Formen mit einer Zunahme der zytoplasmatischen Ausdehnungen (Dendriten) führte. Zu diesem Zeitpunkt enthielten die Kulturen adhärente Zellen mit ausgeprägten zytoplasmatischen Fortsätzen, nicht-adhärente Zellen, die während der dendritischen Zelldifferenzierung morphologische Veränderungen durchliefen, und kugelförmige nicht-adhärente Zellen, die nicht auf die Zytokininduktion ansprachen (Abbildung 4). Nach den Tagen 6–7 bestanden 80–90% der Kulturen hauptsächlich aus Steady-State- und voll differenzierten BMDCs. Diese Zellen wiesen eine sternförmige Form mit umfangreichen zytoplasmatischen Prozessen auf, die für den Antigeneinfang und die Antigenpräsentation optimiert waren. An Tag 7 wurden die BMDCs entnommen, um ihren Phänotyp zu analysieren und funktionelle Assays durchzuführen.

Abbildung 4: Überwachung der Differenzierung dendritischer Zellen aus FTL3L-Knochenmark mit einem konventionellen inversen optischen Mikroskop. (A) Schematische Darstellung der Reinigung hämatopoetischer Vorläufer aus dem Knochenmark der Maus und der Zellkultur in vollständigem Medium, ergänzt durch flt3L B-Bilder von Knochenmarkzellkulturen, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden. Einschübe sind vergrößerte Bereiche des umrahmten Bereichs aus jedem Bild. (B) Tag 0: Bild von kürzlich gereinigten hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmark. Es wird beobachtet, dass, obwohl die Population heterogen ist, die Mehrheit Zellen mit abgerundeter Morphologie und geringer Größe sind. Tage 1-5: Kulturbilder, die die Zunahme der Zellzahl und Veränderungen der Morphologie aufgrund der aktiven Proliferation zeigen, die durch die Aktivierung des FLT3-Signalwegs induziert wird. Die Zellmorphologie geht von abgerundet zu länglich über, mit einer fortschreitenden Zunahme der zytoplasmatischen Fortsätze (Dendriten). Diese Veränderungen sind am deutlichsten, wenn die Zellen an den Vertiefungen der Kulturplatte haften. Tag 6-7: Bilder zeigen vollständig differenzierte BMDCs im Steady State, gekennzeichnet durch eine unregelmäßige Form mit einem markanten Kern und zahlreichen feinen Verzweigungsprojektionen, das Zytoplasma ist hochgranular mit Vesikel, die an der Antigenpräsentation und Immunantwort beteiligt sind. Der Balken steht für 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Da dendritische Zellen essentielle Mediatoren bei der Aktivierung und Ausrichtung der induzierten Immunantwort sind, ist es wichtig, funktionelle Analysen dieser Zellen durchzuführen, um die mögliche Rolle von sEVs bei Wirt-Parasit-Interaktionen aufzudecken. Das hier vorgestellte Protokoll bestätigt, dass BMDCs Parasiten-sEVs nach 1-stündiger Inkubation bei 37 °C einfangen. Interessanterweise scheinen sich die sEVs in endosomal-lysosomalen Kompartimenten zu befinden, in denen vorgeformte MHCII-Moleküle gespeichert sind, da sie kolokalisieren (Abbildung 5).

Darüber hinaus wurden farbstoffstimulierte BMDCs ohne EVs als Negativkontrollen eingeschlossen, um die Markierungsspezifität zu validieren. Es wurden nur unspezifische extrazelluläre Fluoreszenz und 3%–4% der Zellen mit diffusem Farbstoffsignal beobachtet, verglichen mit über 40% der positiv markierten Zellen, die gefärbten sEVs ausgesetzt waren.

Abbildung 5: Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie von BMDCs, die eine effiziente Aufnahme von markierten sEVs und die Rekrutierung von MHC-Klasse II an Endosomen zeigt. (A) Schematische Darstellung des in Punkt 5.3 beschriebenen Protokolls, das die Stimulation der PKH26-markierten sEVs in BMDCs zeigt. (B) Konfokales Bild, das eine Negativkontrolle von PKH26-stimulierten BMDCs ohne Anwesenheit von sEVs zeigt (rot, PKH26) und (blauer DAPI). Ohne die sEVs wurden keine Fluoreszenzsignale vom Farbstoff im Inneren der Zelle beobachtet. (C) Separate Kanäle für konfokale Bilder, die BMDCs zeigen, die mit gefärbten sEVs stimuliert wurden: differentielle Interferenzkontrastmikroskopie (DIC), DAPI (blau, Zellkerne), PKH26 (rot, sEVs) und FITC (grün, MHC-Klasse II). Maßstabsbalken stellen 10 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Protokollablauf für die Kultivierung von Parasiten, die Isolierung von Parasiten-abgeleiteten sEVs, die Unterscheidung dendritischer Zellen aus dem Knochenmark und die Analyse der sEV-Aufnahme durch diese Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Ziel war es, jeden Protokollabschnitt, der als Ganzes oder einzeln durchgeführt werden kann, detailliert zu beschreiben und die wichtigsten Überlegungen zur Gewährleistung der Umsetzung der Methodik hervorzuheben. Die Analyse der Population von EVs, die aus vollständigen parasitären Organismen gewonnen wurden, hat einen konkreten Einfluss auf die Erforschung der Parasit-Wirt-Wechselbeziehung, und genau in diesem Zusammenhang wurde dieses experimentelle Protokoll skizziert.

Die neuen Erkenntnisse über parasitäre Erkrankungen wurden durch die Schwierigkeit der In-vitro-Kultivierung einiger dieser Parasiten behindert. Da Parasitenhelminthen ihren Lebenszyklus unter künstlichen Bedingungen nicht abschließen, können sie in einer Kultur nur als vollwertige Organismen überleben. Daher besteht die in diesem Protokoll vorgeschlagene Lösung zur Untersuchung der Wurm-Wirt-Schnittstelle darin, unabhängig voneinander die Kultivierung jeder parasitären Form (adulter Wurm und verschiedene Larvenformen) durchzuführen, um sEVs anzureichern und zu isolieren, und sie dann mit den Zellen der Zielorgane oder Zellen des Immunsystems des Wirts zu konfrontieren, so dass sie internalisiert oder phagozytiert werden können. beziehungsweise. Darüber hinaus besteht ein kritischer Schritt zur Etablierung einer Helminthenkultur zur Isolierung von EVs darin, lebende Parasiten streng auszuwählen, um die In-vitro-Kultur zu starten, und sie so kurz wie möglich in den Inkubationszeiten zu halten, um das Absterben von Parasiten und die Bildung freier Restmembranen zu begrenzen²³. Um es in E. granulosus zu schaffen, werden die aus Hydatidenzysten gewonnenen Protoskoleces in Glasröhrchen mit kleinem Durchmesser intensiv mit kaltem PBS gewaschen. Bei kräftiger Dispergierung mit einer Pipette sedimentieren die lebenden Protoskoleces schnell. Auf diese Weise werden sie von den nicht lebensfähigen Protoskolen getrennt, die für längere Zeit in der Flüssigkeitssäule des Röhrchens suspendiert bleiben, wodurch sie aufgefangen und aus dem Gemisch eliminiert werden können. Zu diesem Zweck sorgt auch das kräftige Mischen mit einer Pipette bei jedem Waschschritt für das Aufbrechen der Brutkapseln und die Freisetzung der eingeschlossenen Protoskoleces aus ihrem Inneren, wodurch sie von der Umkreismembran befreit werden. Parasitenkulturen werden in Glasröhrchen vom Leighton-Typ etabliert, um eine Adhäsion der sEVs zu vermeiden, und mit einem flachen Teil, um eine verteilte Etablierung der Parasitenkultur zu ermöglichen. Im Falle von Metazestoden, die aus der Peritonealhöhle von Mäusen gewonnen werden, ist es wichtig, die Adventitialschicht, die sie bedeckt, zu trennen und mehrere Waschungen mit PBS durchzuführen, die mit Antibiotika ergänzt werden, um assoziierte Zellen und Darmmikrobiota zu entfernen, was die Reinheit der aus dem Helminthen selbst gewonnenen sEVs beeinflussen kann, wie auch von White et al. ^{beschrieben.23}. Die Röhrchen sind mit sterilen Gummistopfen verschlossen, die dazu beitragen, eine sauerstoffarme Atmosphäre zu erzeugen, die erforderlich ist, um den fermentativen Stoffwechsel nachzuahmen, den diese Parasiten in vivo aufrechterhalten. Schließlich eignet sich das M199-Medium sehr gut als Erhaltungsmedium für das Cestodenlarvenstadium auf lange Sicht^24,25. Das Medium enthält minimale Bestandteile wie Salze, Glukose und essentielle Aminosäuren und enthält darüber hinaus nicht-essentielle Aminosäuren, Cholesterin, Pyrimidine, wasser- und fettlösliche Vitamine sowie Nukleinsäurevorläufer wie Thiamin, Riboflavin und Biotin. Alle diese Nährstoffe fördern die Aufrechterhaltung der grundlegenden organischen Funktionen und die Lebensfähigkeit dieser Parasiten. Das M199 wird insbesondere für nicht transformierte Zellen, Embryonen, primäre Explantate und Organkulturen verwendet und ist optimal für die Zellmassenkultivierung²⁶. Insbesondere muss M199 bei Verwendung als Erhaltungskulturmedium ohne Supplementierung mit fötalem Rinderserum angewendet werden, da es die Obtention vesikularisierter Protoskoleces und deren Dedifferenzierung zu Mikrozysten fördert^27,28.

Alle Bedingungen, die für Parasitenkulturen verwendet werden, müssen dokumentiert werden, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, die die Rückgewinnung und Zellaufnahme von sEVs beinhalten. Ein Aspekt, der die EV-Produktion beeinflusst, ist insbesondere die Zugabe von Verbindungen, die die Kalziumhomöostase beeinflussen, in die Kultur, da sie die Kalzium-abhängige Exozytose erhöhen^29,30. Hier wird die Zugabe von Loperamid, einem intrazellulären Calciuminduktor in E. granulosus^19,31, zu Parasitenkulturen vorgeschlagen, um die sEV-Freisetzung zu verbessern. Diese Methode erhöht die Anzahl der Vesikel in Cestoden (Abbildung 3) und könnte eine gute Strategie sein, um die Produktion in zellulären Systemen mit geringer EV-Freisetzung zu verbessern. Da diese Strategie, wie andere physikalische oder chemische Kulturmodifikationen, jedoch die Eigenschaften und Funktionalitäten von EV verändern könnte, muss bei der Durchführung von Hochdurchsatzanalysen, wie z. B. der Proteomik, besondere Vorsicht geboten sein.

Die Cestodenkulturen ermöglichen das Erreichen von EV-Konzentrationen in hohen Größenordnungen, da ihre äußere Tegumentoberfläche eine synzytiale zytoplasmatische Schicht ist, die an Schlüsselprozesse der Exozytose und Endozytose angepasst ist³². Der Umfang der EV-Vorbereitung wird von den experimentellen Anforderungen abhängen. Insgesamt 9.000 Protoskoleces ergeben durchschnittlich 30 μl sEV mit einer Konzentration von 1–2,5 ' 10⁸ sEV/ml, ausreichend für die parallele Durchführung von DLS-, TEM- und LC-MS-MS-Analysen. Eine Einschränkung des Protokolls besteht darin, eine große Menge an Vesikeln aus Metazestoden aufgrund des Vorhandenseins ihrer laminaren Schicht zu gewinnen, die die Freisetzung von Vesikeln in das Medium behindert. Daher sind große Mengen an Parasiten erforderlich (Schritt 1.3.3)¹¹. Ein alternativer Ansatz besteht darin, auch sEVs aus der Hydatidenflüssigkeit zu analysieren, wie in anderen Studien^{berichtet wurde 11,33,34,35,36}.

In Übereinstimmung mit dem breiteren Trend, der in der EV-Forschung beobachtet wurde, wurde in der Mehrzahl der bisherigen Studien zu Helminthen-EVs die Ultrazentrifugation von Ausscheidungs-/Sekretionsprodukten als primäre Methode zur Isolierung und Trennung von EV verwendet³⁷. In diesem Protokoll wurde die Ultrazentrifugation zur Isolierung von sEVs verwendet, die als Goldstandardmethode für die EV-Rückgewinnung gilt, obwohl sie den Einschluss von Kontaminanten zusammen mit den EVs beinhalten^{kann 15}. Eine Einschränkung dieser Methode ist die Entfernung von löslichen Verunreinigungen. Da sEVs größer sind als lösliche Kontaminanten, besteht eine Alternative zur Verbesserung der Reinigung darin, zusätzliche Schritte einzubauen, wie z. B. die Verwendung der Größenausschlusschromatographie (SEC)^38,39. Wenn jedoch die Isolierung von EVs für funktionelle Analysen erforderlich ist, wie z. B. die Untersuchung der Kommunikation zwischen Helminthen-Parasiten und Wirten, ist die genaue Identifizierung der EV-Population nicht so wichtig, da alle von ihnen antigene Fracht transportieren. Abhängig von der für weitere Experimente erforderlichen Reinheit kann der Isolationsprozess mit einer Ultrazentrifugation enden, wie hier durchgeführt, oder er kann mit anderen Methoden kombiniert werden, wie z. B. der Filtration zur Beseitigung großer Verunreinigungen, der Saccharose- oder Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation oder der Größenausschlusschromatographie, die nicht nur die Reinigung von Verunreinigungen, sondern auch die Trennung verschiedener EV-Populationen ermöglichen^{37. 38,40}. Unabhängig davon ist die hier angewandte Methode einfach und stellt die erste Wahl für die Gewinnung und Anreicherung von sEVs von Parasiten^{dar 39}. Es bietet eine hohe Ausbeute an sEVs zu relativ geringen Kosten, da es nur ein Labor benötigt, das mit einer Ultrazentrifuge ausgestattet ist, in der wiederverwendbare Röhrchen verwendet werden können.

Die Merkmalsbeschreibung der isolierten EVs ist grundlegend für die Bestimmung der Konzentration, Größe, Qualität und des Subtyps von EVs. Darüber hinaus dient die Analyse der Proteinzusammensetzung der Bestimmung, welche EV-Subpopulationen in der Probe angereichert sind, sowie die Abschätzung des Vorhandenseins möglicher Kontaminanten. Die EV-Charakterisierung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, die häufig spezielle Geräte und Einrichtungen erfordern⁴¹. Hier wurde die Größe von Parasiten-sEVs mit Hilfe von DLS analysiert, die in monodispersen Suspensionen zuverlässige Daten liefert, aber in Suspensionen mit breit verteilten EVs weniger präzise ist⁴². Daher könnte eine Alternative die Verwendung anderer Methoden sein, wie z. B. die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), die die Größe und Menge der Vesikel genau bestimmt, die Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS), die einen breiteren Dynamikbereich als NTA bietet, oder das Nano-Flow-Zytometer (NanFCM), das eine höhere Empfindlichkeit als die herkömmliche Durchflusszytometrie besitzt 43,44,45. Als Teil der experimentellen Routine und durch Expertenempfehlungen ermöglicht die TEM-Technik auch die integrale Bestimmung der Reinheit, Ausbeute und Größe der erhaltenen EVs, im Wesentlichen bei Ernten mit hohem EV⁴⁶. Darüber hinaus wird die Untersuchung durch TEM-Analyse besonders empfohlen, wenn es nach der Ultrazentrifugation nicht möglich ist, das EV-Granulat zu visualisieren, um die Zusammensetzung des zurückgewonnenen Materials zu überprüfen.

Diese Fragen unterstreichen die Bedeutung des Einsatzes robuster Techniken für die Isolierung und umfassende Charakterisierung von aus Helminthen gewonnenen EVs, die die Identifizierung spezifischer Marker zur Verfolgung ihres Schicksals erleichtern und damit die Bewertung ihrer funktionellen Rolle ermöglichen könnten.

Extrazelluläre Vesikel, die von E. granulosus gereinigt wurden, stellen natürliche Antigentransportträger mit mehreren charakterisierten und unbekannten antigenen Proteinen^{dar 9}. Allein diese sEVs können antigenpräsentierende Zellen stimulieren, die in verschiedenen Geweben und sekundären lymphatischen Organen des Wirts verteilt sind. Dendritische Zellen sind einzigartige professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die Antigene an naive T-Zellen abgeben können, was den Typ der Immunantwort in vivo bestimmt ^47,48.

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur detaillierten Beschreibung einer Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmarkkulturen von Mäusen, die auf einer zuvor veröffentlichten Forschungsarbeit basieren⁴⁹. Hier wird eine etablierte Methode für Immunstudien vorgeschlagen, die auf der In-vitro-Kultur von Flt3L-getriebenen murinen BMDCs basiert, bei der die Isolierung von Knochenmark ein wesentlicher Schritt ist, um eine erfolgreiche In-vitro-Kultur ^{zu erreichen 50}. Angesichts der Tatsache, dass mehrere Isolationsprotokolle von Knochenmarkzellen heterogene Zellpopulationen produzieren, müssen die BMDC-Kulturen während der ersten Zeit der Flt3L-Differenzierung mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, um den Zellphänotyp für geplante Experimente zu ermitteln 51,52,53. Die phänotypische Charakterisierung von BMDC unter dem Flt3L-Effekt deutet darauf hin, dass es sich bei der Mehrzahl um konventionelle dendritische Zellen (CD11b⁺, CD11c⁺, CD172a⁺) handelt, die dendritischen Zellen ähneln, die in vivo vorkommen und exogene Antigene laden. Während ein kleiner Prozentsatz der BMDC plasmazytoiden dendritischen Zellen (CD11c^+, B220^+, SinglecH⁺) und CD8⁺-ähnlichen dendritischen Zellen (CD11c⁺, CD24⁺ und CD172a^-)^11,53 entspricht.

Einige häufige beunruhigende Schritte sind die geringe Ausbeute an BMDCs in Kultur, die aus Knochenbruch während der Vorbereitung, ineffizienter Knochenmarkextraktion, Zellklumpenbildung, suboptimalen Kulturbedingungen (z. B. Medienzusammensetzung, Temperatur) oder unzureichender Zytokinstimulation resultieren kann. Um diese Probleme zu lösen, gibt es einige Alternativen: das Schneiden hinter den Epiphysen, das vollständige Spülen der Knochenmarkzellen von beiden Seiten der Femure und Tibias, das Erschöpfen des Knochenmarks vor dem Passieren des Zellsiebs, die Verwendung frisch zubereiteter Zytokine in der empfohlenen Konzentration und die Aufrechterhaltung der Sterilität und pH-Stabilität des Kulturmediums.

Es ist zwingend erforderlich, den Ruhezustand der dendritischen Zellen zu gewährleisten, bevor ihre Reifung durch Antigenkontakt induziert wird. Dendritische Zellen erkennen nicht nur ein breites Spektrum an externen Antigenen (PAMPs, pathogen-associated molecular pattern) und internen Antigenen (DAMPs, danger-associated molecular pattern), sondern auch minimale Veränderungen in der Zellkultur (pH-Wert, leichte Bewegung, Zelldichte) können ihre Reifung induzieren. Aus diesen Gründen müssen Bewegungen und Vibrationen der Zellkultur während der Handhabung in der Zentrifuge oder im Inkubator minimiert werden. Darüber hinaus sollte das Pipettieren reibungslos erfolgen, ohne dass Blasen im Medium entstehen. Darüber hinaus kann die Aufrechterhaltung von Primärkulturen für mehr als 8 Tage dendritische Zellen aktivieren und den Zelltod fördern. Außerdem führt eine höhere Zelldichte als 2,5 x 10⁶ zu einer höheren MHCII-Expression⁵⁴ und erhöht die Reifung vor dem Antigenkontakt. Außerdem müssen alle verwendeten Reagenzien vollständig frei von Endotoxinen oder LPS sein, eine Folge einer früheren Kontamination mit gramnegativen Bakterien, da das LPS eine Stimulation oder Erschöpfung der dendritischen Zellen induziert^23,55. Um die Sterilität während der Manipulation der Knochenmarkkulturen aufrechtzuerhalten, muss neben dem Einsatz von Antibiotika in den Medien kontinuierlich 70%iges Ethanolspray auf der Oberfläche, den behandschuhten Händen und den Schrankgegenständen verwendet werden, um den Kontakt zwischen Ethanol und Knochenmarkzellen zu erhalten. Bevor Sie die Instrumente Knochen oder Zellen aussetzen, stellen Sie sicher, dass das Ethanol verdampft ist, und trocknen Sie sie an der Luft, da es für Knochenmarkzellen giftig ist.

Dendritische Zellen fördern ihre Reifung und Zytokinproduktion, nachdem sie sEVs erkannt und phagozytiert haben. E. granulosus sEVs induzieren die Expression von IL-12, was das Th1-Profil begünstigt⁹. Ist die phänotypische Reifung der dendritischen Zellen mangelhaft, muss die Zeit bzw. die Konzentration des Stimulus, die mit den zugesetzten sEVs erreicht wird, optimiert werden. Die konfokale Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Internalisierung und Kolokalisation von Fracht mit MHC-Molekülen auf dendritischen Zellendosomen sichtbar zu machen. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie nach mindestens 8 Stunden der Aufnahme von sEVs auch zur Messung von intrazellulären Zytokinen und Oberflächenmolekülen wie CD40, CD80, CD86 und MHCII in reifen dendritischen Zellen verwendet werden^11,13.

Umfangreiche Forschung, bei der eine breite Palette von Techniken zum Einsatz kommt, wird ein tieferes Verständnis dafür ermöglichen, wie die Größe, Herkunft und Fracht von Parasiten die Reaktionen des Wirts beeinträchtigen und verändern können.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die Autoren erkennen Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentinien) und Lic. iur. Leonardo Sechi und Lic. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, Argentinien) für die technische Unterstützung bei der Transmissionselektronenmikroskopie bzw. der dynamischen Lichtstreuung. Wir danken auch Dra. Graciela Salerno, Dra. Corina Berón und Dr. Gonzalo Caló für den Einsatz der Ultrazentrifuge am INBIOTEC-CONICET-FIBA, Argentinien. Die Autoren danken Lic. Kelly (SENASA, Mar del Plata, Argentinien) und Lic. iur. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentinien) für ihre Zusammenarbeit bei der Bewertung des Wohlergehens von Mäusen und Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez und Med. Vet. L. Netti für ihren Beitrag zur Gewinnung von Parasitenmaterial. Diese Arbeit, einschließlich der Kosten für Experimente, Reagenzien und Ausrüstung, wurde durch das PICT 2020 Nr. 1651 unterstützt, das vom ANPCyT finanziert wurde.