从人阴道中组织处理和分离原代成纤维细胞

对主要影响女性人群的疾病的研究研究不足，资金不足。盆腔器官脱垂是与女性密切相关的疾病。当肌肉和韧带变弱并导致盆腔器官在骨盆中下降，从而在阴道中形成隆起时，就会发生这种情况。

对这种病理生理学背景下的细胞相互作用知之甚少，也知之甚少组织水平因素如何影响手术干预的成功。从人阴道中分离原代成纤维细胞可能有助于研究盆腔器官脱垂的生物学机制。盆腔器官脱垂通常影响老年人或绝经后个体。

由于老年供体的细胞群减少和克隆形成能力，这种情况的原代成纤维细胞的分离和增殖研究具有挑战性。大多数使用人类阴道样本的论文都使用了盆腔器官脱垂的绝经前个体的组织。尽管一些论文报告了使用绝经前和绝经后个体的样本，但它们没有足够详细地描述用于从老年或绝经后供体中成功分离成纤维细胞的方案。

使用绝经后组织中的成纤维细胞进行分离和疾病建模对于了解盆腔器官脱垂的细胞病理生理学可能是必不可少的，因为这种情况在绝经后十年内的个体患病率最高，我们描述了一种使用机械和酶解离相结合从人类阴道组织中分离和培养富含成纤维细胞的单细胞悬液的方法。本文介绍了有关如何获取绝经后或衰老人类阴道成纤维细胞的可靠方案。对收获的组织进行组织学分析以验证方案。

测量并切割组织至约 1 平方厘米的大小。确保精确测量活检大小。准备两到三个额外的阴道活检，每个来自单个供体的尺寸为 1 平方厘米，然后将活检放在一边。

将阴道活检放入细胞培养皿中后，使用两把无菌手术刀将阴道组织切成小碎片。确保刀片的尖端垂直于组织表面。使用两把手术刀在组织表面施加相等且稳定的压力。

执行交替拉动动作，将组织切成非常小的块。使用两把手术刀重复这种切碎技术，直到样品均匀稠度，有 1 到 2 毫米的碎片。向板中加入 2 至 3 mL 无血清细胞培养基，悬浮切碎的组织。

上下移液管含有组织碎片的溶液以打碎任何团块。将含有组织碎片的溶液转移到 15 mL 锥形管中。添加额外的无血清细胞培养基，直到总体积为 10 mL。

将 Liberase 以 230 微升等分试样储存以供使用。向试管中加入 230 微升 Liberace。使用样品混合器将试管在 37 摄氏度下孵育 3 小时，并持续剧烈搅拌。

保持持续的激动。在孵育过程中每隔 30 分钟涡旋试管。将样品以 3000 G 离心 5 分钟，去除并丢弃上清液。

将沉淀重悬于 1 至 2 mL 含 10% 胎牛血清的细胞培养基中，以稀释 Liberase。用力移液，直到沉淀完全重新悬浮。通过在细胞过滤器上轻轻移液溶液来过滤组织酶悬浮液。

将来自同一供体的多个组织活检的细胞悬液一起提取。用无菌 5 毫升注射器的柱塞，压过过滤器上的组织酶悬浮液。重复此步骤，直到剩余的组织碎片似乎被完全压穿。

板从来自同一供体的多个阴道活检中取出细胞悬液，放在一个培养皿上。在 37 摄氏度下孵育过夜后，用相差显微镜观察细胞。确保显微镜聚焦在板的底部。

少量成纤维细胞将附着在底部。这是该协议的图示表示，突出显示了关键步骤。图 2 显示了悬浮细胞在第 0 天的相差图像。

图 3 是培养第 14 天阴道原代成纤维细胞的相差图像，放大倍率为 100 倍，来自三个 1 厘米见方的组织活检的拉悬液。表 1 显示了在当前研究中使用其他方案尝试分离阴道成纤维细胞的结果。通过芒通阳性染色鉴定成纤维细胞。

对此处所示的绝经前和绝经后阴道组织进行免疫荧光分析。图像以 200 倍放大倍率拍摄。绝经前和绝经后组织样本中分离的成纤维细胞也用 α 平滑肌肌动蛋白和 F 肌动蛋白染色。

我们开发了一种优化且可靠的方案，用于从老年供体的阴道粘膜中分离原代成纤维细胞。在本研究中，使用先前发表的动物和人体组织解离原代细胞的方案未能从人阴道样本中提取任何成纤维细胞。我们假设细胞从人类阴道组织解离挑战的两个可能原因。

与非粘膜组织相比，老年供体的粘膜真皮厚度更大，并且老年人的成纤维细胞密度可能显着降低。一些关键步骤不应修改。实施非常严格的机械消化，使用双手术刀技术，并将单个供体的 3 到 4 个全层活检的细胞悬液拉在一起。

我们的协议具有明显的优势。机械和酶消化可以提高绝经后组织的产量，但不会对绝经前样本产生负面影响。我们承认我们的协议存在一些限制。

在未进行阴道脱垂手术的情况下，接触人体阴道组织可能具有挑战性，并且需要提取多个组织活检样本的细胞悬液也可能是一个限制。这种需要人阴道成纤维细胞的方案将成为未来盆底疾病研究的有用工具，尤其是在绝经后个体中，也是女性健康研究的重要补充。