以下协议通过快速、高效地重新编程从皮肤冲孔活检中分离出的人类皮肤纤维细胞，提供自体人类诱导多能干细胞的说明。这些程序可以由在细胞重新编程方面经验很少或没有经验的研究人员进行，并且通过适当的调整，允许无异种诱导多能干细胞的产物。自体IPS细胞可用于再生医学应用和建模疾病，如遗传性疾病或癌症，以调查潜在的分子机制和开发更具体的疗法。
工作负载很高。在仔细规划实验之前研究协议非常有帮助，包括应准备试剂和材料的步骤。该程序的视觉演示有助于经验很少或没有经验的研究执行细胞分离和重新编程，避免与可能的微生物和RNA污染相关的常见错误。
在无菌罩下，用HPSS溶液从腹部清洗新鲜获得的人体皮肤样本，用HPSS溶液清洗。用细钳和剪刀去除头发和脂肪，用手术刀解剖，获得两毫米一毫米大小的碎片，避免疤痕，脏或烧伤的组织区域。在每个35毫米的盘中放置四个小碎片，盖上无菌盖玻璃，并添加1.5毫米的 I-DMEM。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板约15天，或直到细胞达到85%汇合。每三天更换一次培养培养，每天使用倒置相对比显微镜检查细胞的生长。现在，用细钳子抬起盖杯，将它们倒置在 100 毫米的盘中，用 1X 无菌 PBS 清洗。
取出样品的碎片并丢弃它们。用 1X 无菌 PBS 清洗板。取出 1X PBS，在放置在 100 毫米盘中的盖眼镜中加入 3 毫米的 Trypsin-EDTA，并在 35 毫米的盘子中加入 1 毫米的 Trypsin-EDTA。
在37摄氏度下孵育5分钟，吸收5%的二氧化碳。然后，通过向 100 毫米盘添加 5 毫米 TSS 和在每个 35 毫米的培养皿中添加 2 毫米 TSS 来阻断三辛化。将悬浮液收集到15毫米无菌管中，在4摄氏度下以400倍G离心，5分钟。
吸制上能物，在12毫米的 I-DMEM 中重新暂停颗粒。将悬浮液分成三毫米等分，然后将它们转移到一个60毫米的板中。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。
每天更换媒体。保持细胞在培养中，直到它们达到75%的汇合后，重复三次尝试性，以获得细胞，通过四。然后，将 I-DMEM 替换为 S-DMEM，在 37 摄氏度下用 5% 的二氧化碳孵育 48 小时，使细胞同步。
在细胞同步过程中，为成纤维细胞免费编程准备成纤维细胞膨胀介质和完全未修改RNA重新编程鸡尾酒。为了简化9管未改性RNA等分的制备，这些等分管被分成36个，我们习惯了一个附着在罩壁上的方案。通过将 100 微升的地下室膜基质解冻到每孔，将 24 孔板均匀地覆盖底部，使 24 孔板涂覆。
在37摄氏度下孵育至少一小时，然后播种细胞。用培养中的细胞从板中吸出介质，并在 1X PBS 中快速清洗。重复尝试性，以获得通过五的细胞。
吸制上一样物，并在适当体积的成纤维细胞膨胀介质中重新暂停颗粒。用 70% 酒精准备和清洁血细胞计。然后，在1.5毫升管中轻轻混合10微升的尝试蓝色和10微升的细胞悬浮液，在室温下孵育一至两分钟，以备2分钟之用。
将溶液的10微升移液放入血细胞计中，并放在倒置相对比显微镜的舞台上进行计数。不可行的细胞是蓝色的，而活的细胞是无污染的。数血细胞计室至少两个正方形中的细胞。
进行稀释，获得每500微升成纤维细胞膨胀介质的2.5倍至第四细胞的密度，并重新暂停细胞颗粒。移液 500 微升的细胞悬浮到 24 井板的每个井中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞过夜。
早晨，从每一个井中去除旧介质，代之以500微升预扎的无因素培养基。在37%摄氏度下孵育，在5%二氧化碳下至少6小时。在室温下解冻五个 15.4 微升共 nmRNA 重编程鸡尾酒，然后将它们放在冰中。
将234.6微升的减少血清介质加入到每种分体中，轻轻移液三至五次，并将每根都标为管A.Label五个无菌无RNase 0.5毫升管作为管B，并将6微升合成小干扰RNA转染试剂与244微升的减量血清介质混合。然后，使用移液器将每个管B的内容添加到管 A 滴明智。通过敲击管的底部混合。
在室温下孵育15分钟。之后，将125微升的nmRNA转染复合溶液从5个等分到每一个井，将板和移液器向下倾斜到介质中。轻轻摇动，将 20 孔中的内容混合。
使用其余四个孔作为参考。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板15小时。第二天，吸媒体。
在无菌罩下，重复转染程序，如第一天，每天三天以上。第五天，吸气介质，并在无菌罩下与新鲜、预热的 XF/FF 培养介质进行交流。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。
每天通过相位对比显微镜监测细胞培养，直到观察IPC菌落的形成。该协议的目的是使用非集成重新编程方法重新编程从腹部皮肤分离的皮肤纤维细胞。人类成纤维细胞在培养后一周内从腹部皮肤样本中脱光，在两周内达到85%的汇合率。
细胞的特点是塑料培养皿上的粘合剂生长，其形态从拉长和主轴形状到扁平和星形。成纤维细胞的形态和排列及培养在BMM上播种后发生显著变化，它们获得了拉长形态，并排列成细枝形结构。小菌落在第一天从第一次转染开始在文化中已经可见，其规模随着时间的推移而逐渐增大，而它们的数量增加到第七天，然后在第七天至第14天之间保持稳定，这可能是由于较小的菌落合并形成更大的菌落。
由于重新编程程序是使用无抗生素介质进行的，在无菌条件得不到保证的情况下，微生物污染成为一个主要问题。增殖率和电镀密度影响重新编程效率，因此根据细胞增殖率规划细胞传通和确定电镀密度十分重要。该协议将动物源试剂替代为适当的无异种试剂，允许在非临床用途的完全无异种培养环境中将成年人类成纤维细胞重新编程到 IPS 细胞中。
人体细胞是血液传播病原体的潜在感染源，因此，在整个过程中应佩戴个人防护设备。
