主に女性の性別の人々に影響を与える障害に関する研究は、研究が不十分で、資金も不足しています。骨盤臓器脱は、女性の性別に強く関連する障害です。これは、筋肉や靭帯が弱くなり、骨盤内臓器が骨盤内で下がり、膣内に膨らみが生じるときに発生します。
この病態生理学の文脈における細胞相互作用についてはほとんど知られていません、また、組織レベルの要因が外科的介入の成功にどのように影響するかについても。ヒトの膣からの初代線維芽細胞の単離は、骨盤臓器脱の根底にある生物学的メカニズムの研究に役立つ可能性があります。骨盤臓器脱は、一般的に高齢者または閉経後の個人に影響を及ぼします。
初代線維芽細胞の単離と増殖 この状態の研究は、細胞集団の減少と高齢のドナーのクローン形成能力のために困難です。ヒトの膣サンプルを使用するほとんどの論文は、骨盤臓器脱の閉経前の個人の組織を利用しています。閉経前と閉経後の両方の個人からのサンプルの使用を報告した論文はいくつかありましたが、高齢または閉経後のドナーから線維芽細胞を成功裏に分離するために使用されたプロトコルについて十分に詳細に説明されていませんでした。
閉経後の組織からの線維芽細胞を用いた単離および疾患モデリングは、骨盤臓器脱の細胞病態生理学を理解するために不可欠であり得る。この状態は閉経後の10年間で個人において最も高い有病率を有するため、我々は、機械的および酵素的解離の組み合わせを使用して、ヒト膣組織からの線維芽細胞が豊富な単一細胞懸濁液の単離および培養の方法を説明する。この記事では、閉経後または老化したヒト膣線維芽細胞を取得する方法に関する信頼性の高いプロトコルについて説明します。採取した組織を組織学的に分析し、プロトコールを検証しました。
組織を測定し、約1センチメートル四方のサイズにカットします。生検サイズを正確に測定します。1人のドナーからそれぞれ1cm四方を測定する2〜3回の膣生検を追加で準備し、生検を脇に置きます。
膣生検を細胞培養ペトリ皿に入れた後、2つの滅菌メスを使用して、膣組織を小さな断片に刻みます。ブレードの先端が組織の表面に対して垂直になっていることを確認します。2つのメスを使用して、組織表面に均等で安定した圧力をかけます。
交互に引っ張る動作を実行して、組織を非常に小さな断片に切断します。2つのメスを使用して、サンプルが1〜2ミリメートルのピースで均一な一貫性になるまで、このミンチ技術を繰り返します。2〜3ミリリットルの無血清細胞培養培地をプレートに加え、ミンチ組織を懸濁します。
組織片を含む溶液を上下にピペットで動かし、塊をバラバラにします。組織片を含む溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。総容量が10ミリリットルになるまで、無血清細胞培養培地を追加します。
リベラーゼは230マイクロリットルのアリコートで保管して使用してください。チューブに230マイクロリットルのリベラーチェを追加します。サンプルミキサーを使用して、チューブを摂氏37度で3時間インキュベートし、絶えず激しく攪拌します。
一定の攪拌を維持します。インキュベーション中に30分間隔でチューブをボルテックスします。3000 Gで5分間サンプルを遠心分離し、上清を取り除き、廃棄します。
ペレットを10%ウシ胎児血清を含む1〜2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁して、リベラーゼを希釈します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、激しくピペットで動かします。組織酵素懸濁液を細胞ストレーナー上で静かにピペッティングして、組織酵素懸濁液を濾します。
同じドナーの複数の組織生検から細胞懸濁液を一緒に引き出します。滅菌済みの5ミリリットルシリンジのプランジャーで、組織酵素懸濁液をストレーナーに押し込みます。残りの組織片が完全に押し込まれているように見えるまで、この手順を繰り返します。
プレートは、単一のペトリ皿上で同じドナーからの複数の膣生検から細胞懸濁液を引き出しました。摂氏37度で一晩インキュベートした後、位相差顕微鏡で細胞を観察します。プレートの底に顕微鏡の焦点が合っていることを確認します。
底部には少数の線維芽細胞が付着します。以下は、プロトコルを図式化したもので、主要なステップが強調されています。図2は、0日目の懸濁細胞の位相コントラスト画像を示しています。
図3は、1cm四方の組織生検3回の引っ張られた懸濁液からの100倍の倍率での培養14日目の膣初代線維芽細胞の位相コントラスト画像です。表 1 は、この現在の研究で膣線維芽細胞の分離を試みるために他のプロトコルを使用した結果を示しています。線維芽細胞は、マントンの陽性染色によって同定されました。
免疫蛍光分析は、ここに示す閉経前および閉経後の膣組織に対して行いました。画像は200倍の倍率で撮影しました。単離された線維芽細胞は、閉経前および閉経後の組織サンプルでアルファ平滑筋アクチンおよびFアクチンでも染色されました。
私たちは、高齢のドナーの膣粘膜から一次線維芽細胞を単離するための最適化された信頼性の高いプロトコルを開発しました。初代細胞の解離のための動物およびヒト組織に対する以前に発表されたプロトコルの使用は、この研究ではヒト膣サンプルから線維芽細胞を抽出することができませんでした。私たちは、ヒトの膣組織からの細胞解離の課題について、2つの考えられる理由を仮定しています。
粘膜の真皮の厚さは、高齢のドナーで大きく、非粘膜組織のそれと比較すると、線維芽細胞の密度は高齢者で著しく減少する可能性があります。いくつかの重要な手順は変更しないでください。非常に厳密な機械的消化の実施、2つのメス技術を使用し、単一のドナーの3〜4つの全層生検の細胞懸濁液をまとめます。
私たちのプロトコルには明確な利点があります。機械的および酵素的分解により、閉経後組織の収量が向上しますが、閉経前のサンプルに悪影響を与えることはありません。私たちは、私たちのプロトコルにいくつかの制限があることを認めています。
膣脱手術が行われていない状況では、ヒトの膣組織へのアクセスが困難になる可能性があり、複数の組織生検サンプルの細胞懸濁液を吸引する必要性も制限となる可能性があります。ヒト膣線維芽細胞を必要とするこのプロトコルは、骨盤底障害、特に閉経後の個人の将来の調査に役立つツールであり、女性の健康研究への重要な追加となるでしょう。
