使用免疫过氧化物酶和免疫荧光方法鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体

目前，免疫组织化学被使用的频率越来越高，以确定特定分子标记的存在及其在病理情况下的变化，使根的可能性进行定量分析。免疫组织化学，主要是免疫荧光技术，用于幼虫和成年斑马鱼动物模型，但对斑马鱼良好的免疫组织化学方案了解很少。在这里，我们描述并说明一个协议，可以用来研究成年斑马鱼中重要蛋白质的进化保护。

成年斑马鱼免疫组织化学的一个很好的方案有助于确定这种动物模型对研究高度保守的生物分子的形态表达和分布的有用性。这种方法还有助于分析这些生物分子由于与人类生理病理学相关的病理条件而可能改变的。演示这个程序的将是来自我实验室的博士生Lea Tunisi博士。

要开始此过程，请将准备好的冷冻组织块转移到低温恒温器中，温度为零下 20 摄氏度。切块在日冕或下垂部分10微米。然后，将替代序列部分的组织收集到适合免疫组织化学的粘合玻璃幻灯片上，并将其储存在零下 20 摄氏度，直到准备好继续。

首先，使用耐溶剂笔标出幻灯片上的组织区域。使用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次五分钟。接下来，在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液的 100 毫升中溶解 0.3 毫升 Triton X-100，以准备 Triton X-100 0.3% 溶解 0.1% 正常驴血清，在磷酸盐缓冲液中含有 0.3% Triton X-100，以准备阻断溶液。

用普通驴血清溶液在渗透缓冲液PB-Triton X-100 0.3%中孵育各部分，在室温下30分钟，使细胞膜渗透，并阻断非特异性结合位点。首先，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次五分钟。加入在PB-T中稀释的原抗体混合物，并在室温下在潮湿盒子里孵育部分过夜。

第二天，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次五分钟。在室温下孵育部分两小时，在PB-T中稀释的二级抗体的适当组合中孵育部分。首先，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次五分钟。

将1.5微升DAPI溶解在三毫升磷酸盐缓冲液中，以准备核染料DAPI。对染料中的部分进行反色。然后，使用安装介质盖住幻灯片，以稳定组织和污渍，供长期使用。

荧光样品可以储存在黑暗中四摄氏度。重复免疫荧光方案，省略初级或二级抗体，或用磷酸盐缓冲液替代初级或二级抗血清，以准备阴性控制。接下来，重复免疫荧光方案，并预吸收每个原抗体与多余的相对肽。

在小鼠大脑切片上重复免疫荧光协议，以准备积极的控制。使用配备 X-Y-Z 电动舞台、数码相机以及采集和分析软件的共体显微镜观察和分析免疫区段。以 5 倍、20 倍和 40 倍的目标获取数字图像。

在每个可用通道中以低放大倍率拍摄每个部分的图像，以组成低放大倍蒙太奇。使荧光图像标准化，以达到最大对比度和叠加。在整个感兴趣区域，通过六个焦平面收集连续 Z 堆栈图像，焦步为 1 到 1.8 微米。

分别对每个通道执行此集合。在此之后，使用映像去卷积软件通过应用 10 次迭代来解构图像，并折叠串行 Z 平面图像到单个最大投影图像。使用适当的图像编辑软件调整微图的光线和对比度。

对成年斑马鱼肠道的OX-A和OX-2R分布的免疫组织化学分析表明，OX-A和OX-2R的不同定位点及其在DIO斑马鱼肠道细胞中的表达增加。在中肠和前肠的细胞中观察到OX-A强烈的棕色染色。OX-A 的免疫表达在不同的肠道隔间中发出清晰的信号，从前部向中肠方向下降。

在DIO肠道和控制饮食斑马鱼的OX-2R免疫表达中观察到类似的结果。DIO 成年斑马鱼中 OX-A 信号增加，同时在其他肠道隔间中过度表达 OX-2R。对免疫荧光图像的精确分析表明，与控制性饮食斑马鱼相比，DIO成年斑马鱼肠道的OX-2R/CB1R结肠化增加。

在不同的大脑区域也观察到类似的情况，如后脑电图、下丘脑、光学肿瘤、圆环后叶和低劣叶的扩散核。通过用奥雷辛-A和CB1R联合进行双重免疫，观察到下丘脑的奥雷辛热神经元的结肠化增加，同时也伴随着奥雷辛-A荧光信号的增加。这些结果表明，双重免疫荧光如何帮助识别生理上保存的蛋白质表达、目标蛋白质的结肠化，以及它们在不同病理条件下的分布和/或表达变化。

使用免疫荧光，我们可以更好地了解生物分子的共分布和共表达，它们可能的相互作用，我们也可以在不同病理的情况下有一个可见的图像。此外，代谢酶表达或受体的神经原子分布可能进一步揭示蛋白质信号在组织中的作用。本技术工作介绍了利用成年斑马鱼模型研究两种高度保存的系统，即奥雷辛和内啡肽的免疫荧光方法。

在成年斑马鱼的大脑中首次使用此协议，尚未确定奥雷辛-2受体和内啡肽-CB1受体的解剖分布和共表达。我们建议此处描述的免疫组织化学实验的协议，并检测成年斑马鱼肽中受体的空间分布和组织，以更好地了解其功能。