斑马鱼胚胎和幼虫的整个山免疫性化学

全安装免疫组织化学是一种相对快速和简单的技术，允许使用标记抗体直接在组织或生物体中对蛋白质进行空间和时间观察。这项技术的实用性是，它允许染色一个完整的组织或生物体，而不必第一节它和共物显微镜可以用来产生蛋白质表达模式的三维表示。免疫史托化学在生物医学研究中被广泛用于了解疾病的病因和分子机制。

它也是一个有价值的诊断工具，用于识别病理样本中的肿瘤。首先，准备装满系统水的产卵池，并准备好网状或槽槽衬垫。将成年斑马鱼混合性对成组在水箱过夜。

使用 14 小时/10 小时的光/暗循环，9 点 9 .m。第二天早上，随着灯的亮起，用新鲜的系统水改变产卵罐水以清除粪便。一旦产卵，将成人返回家中。

使用转移移液器绘制鸡蛋来收集它们。将50个卵子转移到每个装满胚胎培养的培养皿中。取出任何不透明和多云的卵子，这些鸡蛋已经死亡或无法分割。

在28.5摄氏度下孵育鸡蛋，直到受精后23小时。如果胚胎在受精后超过24小时，用移液器将胚胎移植到胚胎介质中的200微摩尔PTU，以防止黑色素生成。在立体显微镜下，使用超细的尖端钳子对未带帽子的胚胎进行脱光。

使用火抛光的巴斯特移液器，以尽量减少损害，将它们转移到玻璃或塑料培养皿涂有1-2%的阿加罗斯溶解在胚胎介质中。然后使用塑料或火抛光移液器将胚胎移植到1.5毫升离心管。用微管取出胚胎介质。

只留下足够的液体来覆盖胚胎。在室温下轻轻摇动，将胚胎在4%PFA中固定一到两个小时。接下来，在1XPBS和1%PBTriton中清洗胚胎三次，洗涤5分钟。

立即使用胚胎或在4摄氏度下储存长达一周。对于长期储存，脱水和储存胚胎在100%甲醇在零下20摄氏度。要补充胚胎水分，在室温下进行连续孵育五分钟，同时减少甲醇、PBS和PBTriton的量，进行最后的洗涤。

根据手稿继续胚胎制备。选择与二级抗体宿主物种匹配的阻断溶液，例如 PBTriton 中每毫升 BSA 有或没有两毫克的 10% 山羊血清。在含有胚胎的管子中加入0.5毫升的阻块溶液，并在室温下将管子放在摇杆上一至三个小时。

然后在震撼时在四摄氏度下孵育原抗体稀释的阻断溶液和PBTriton。早晨，在PBTriton中清洗胚胎五次，每次在室温下摇动10分钟。然后根据初级抗体的宿主种类和488纳米所需的波长选择二级抗体。

将稀释的二级抗体放入含有胚胎的管子中。用铝箔盖住管子，在室温下孵育两小时，同时摇动。之后，在PBTriton中清洗胚胎三次，在室温下清洗10分钟，同时用铝箔和摇动覆盖。

使用移液器，将胚胎转移到PBS中50%甘油溶液的床上，在胚胎介质中，在2%的阿加罗斯的床上。要去除蛋黄，请将 200 升 1X PBS 微升转移到凹陷滑梯或普通玻璃滑梯上。使用塑料转移移液器将一个或多个胚胎移动到 PBS 液滴。

使用超细钳和双零昆虫针来分离蛋黄，非常轻轻地从胚胎的腹体表面刮黄粒。取出蛋黄颗粒，并根据需要补充 PBS。安装后，将样品放在显微镜舞台上。

通过选择相对明亮的示例找到感兴趣的区域。调整摄像机曝光和增益，使信号足够明亮而不饱和。在比较实验抗体标记胚胎和控制抗体胚胎时，使用相同的暴露设置。

全山免疫基础化学的这一协议是利用斑马鱼发育研究时空蛋白表达的宝贵工具。NMDA型谷氨酸受体的GluN1亚单位在受精后23小时显示谷氨酸受体亚基在发育斑马鱼肌肉过程中的表现。受精后72小时胚胎的冷冻部分被安装在幻灯片上，并免疫，用于磷-H3，这是增殖细胞的标志。

几个细胞表示磷-H3，在心室区域最显著。小鼠IgG控制抗体和排除原抗体揭示了非特异性表达水平低。重要的是要选择适当的阻断解决方案和二级抗体基于主要抗体宿主物种，以确保检测和尽量减少非特异性染色。

必须验证免疫历史化学，以确保所观测到的信号实际上是感兴趣的蛋白质。后续实验通常涉及使用基因或环境改造的生物体。免疫组织化学使研究人员能够就地观察蛋白质，大大加快了我们对基础和应用生物学中许多系统的理解，特别是在胚胎发育过程中。

甲醇和甲醛是有毒的，应谨慎处理。废物需要按照体制程序收集和处理。