本视频将为体外形状实验提供详细的方案，以确定RNA序列的二级结构，即RNA针对小分子的存在。体外形状是一种经济有效的方法来了解每个核苷酸在氨基酸大小的RNA元素上的动态，该元素通常少于200个核苷酸。在准备手稿中描述的RNA模板后，通过添加伽玛32P ATP，逆转转录底法，对转录底剂进行放射性标签逆转转录底剂。
10XPNK反应缓冲液、多核苷酸激酶和RNA自由水在1.7毫升微离心管中，总体积为20微升。然后在37摄氏度下孵育一小时。然后，从 65 摄氏度开始激活样品 20 分钟，然后在脱盐柱中过滤样品，然后以 1000 倍 G.添加 25 微升 2XTBE 尿素样品缓冲液和混合物进行离心机。
将这些贴有标签的产品降入 10%丙烯酰胺凝胶中，并确保避免将放射性出血到顶部储液罐中。以 20 瓦的功率运行凝胶一小时。运行后，取出凝胶盒的玻璃板。
将凝胶放在塑料包装上。将塑料折叠到凝胶顶部，制作一个气密三明治。将凝胶三明治放在钙通态荧光屏上，用想象仪器曝光。
用常规光线再次对凝胶进行成像，以了解凝胶的边缘在哪里。使用图像处理软件覆盖两个图像并覆盖浅色和深色图像。然后使顶部图像稍微不透明，以便同时查看两个图像。
确保打印的图像与实际凝胶具有相同的大小。然后将凝胶对齐在打印的图像上。最后，使用消毒剃须刀刀片将所需的弯曲从凝胶中切出，将每块凝胶放在单独的 1.7 毫升微离心管中。
要通过被动洗脱从凝胶片中恢复DNA，每1.7毫升管中加入0.3毫升的洗脱沉淀混合物。在4摄氏度的旋转器上将管子在放射性安全容器中孵育16小时。孵育后，将液体转移到新的1.7毫升管中。
加入2.5倍冰冷200防乙醇，并反转管子六次混合液体。在零下80摄氏度下孵育管子至少一小时。在10000克和4摄氏度的离心10分钟后，通过移液小心地取出上一液。
加入一毫升80%乙醇来清洗颗粒。涡流15秒，在相同条件下再次离心。通过移液去除上流水器后，风干DNA颗粒五分钟。
加入50微升RNA自由水，通过上下移液10次混合。在闪烁计数器中，DNA浓度标准化为每分钟约10万个微升计数。要准备四个用于化学修饰的样品，在 32 微升 0.5 XTE 缓冲液中加入 8 个 RNA 图片，加入 1.7 毫升微离心管。
在80摄氏度下加热两分钟，在冰上加热至少一分钟。然后加入8个5倍折叠混合微升，将这种RNA混合物的9微升混合到四个PCR管中，从1个到4个。将一微升10%DMSO加入管中标为一，一微升浓缩小分子溶液入管二，一微升稀释小分子溶液放入管三和一微升水到管四。
在热循环器中，在 37 摄氏度下孵育所有 PCR 管 30 分钟。直接在两个主 OH 改性反应之前，在三微升 DEPC 处理水中稀释两个摩尔 NAI 库存溶液的一微升，产生 0.5 摩尔工作溶液。立即将溶液的一微升添加到管一、二和三中。
将 25%DMSO 的微升加入第四管，在 37 摄氏度的热循环器中孵育 15 分钟。准备四个新鲜的1.7毫升微离心管，并在每个管中加入100微升的洗脱沉淀混合物和两个微升的糖原。然后，从相应的PCR管中转移所有液体。
在每个管中加入0.34毫升的冰冷200证明乙醇，通过涡流混合5秒钟。将管子放在零下80摄氏度的冰柜中至少一小时。然后在摄氏4度的14，000倍G下将管离心15分钟。
在不干扰RNA颗粒的情况下，从每个管中去除上一液。每管加入0.5毫升80%乙醇，清洗RNA颗粒和漩涡15秒。在相同条件下再次离心后，取出上经液并风干RNA颗粒五分钟。
加入9微升RNA的免费水，并上下管10次混合。将修改后的RNA转移到四个新的PCR管中，并像上一步一样将它们贴上一到四个标签。在 7 微升 DEPC 处理水中加入两个 RNA 图片，每个微升的 PCR 管中加入两个 RNA，并标记数字 5 至 8。
在标有一至八的八个 PCR 管中，每个管中加入两个回收的无线电标记底材的微升。在65摄氏度加热5分钟后，在热循环器中立即冷却至4摄氏度。在每个管中加入四个 5x RT 缓冲液的微升、一个 0.1 摩尔 DTT 的微升和一个 DNTP 混合的微升。
然后将两升DEPC处理的水加入一至四管。在管五中加入四微升五毫摩尔 ddATP，将四微升五毫摩尔 ddTTTP 添加到管六和四微升五毫摩尔 ddCTP 到管七和一微升五毫摩尔 ddGTP 和三微升五毫摩尔 ddGTP 和三微升 DEPC 处理水到管八和移液器四次混合。在热循环器中，所有PCR管在52摄氏度下加热一分钟后，在每个管中加入一微升的逆转录酶，然后上下管四次混合。
在热循环器中，在52摄氏度下孵育反应20分钟。要对RNA进行水解，将一升五摩尔氢氧化钠的微升加入每个管中，并在95摄氏度下加热5分钟。然后加入五微升一摩尔盐酸，以中和反应，并重复乙醇沉淀，如前面所述。
在风干DNA颗粒5分钟后，在1.7毫升管中加入10微升水和10微升2xTBE尿素样品加载缓冲液，上下管10次，重新溶解。在70摄氏度下加热样品5分钟，然后将管子放在冰上，然后装入凝胶。将放在冰上的样品的10微升加载到8%聚丙烯酰胺测序凝胶上。
以 65 瓦的功率运行凝胶两小时，或直到底部染料达到凝胶的 3/4。拆下垫片，轻轻插入铲子以拆下顶部硅化玻璃板。用一块大滤纸盖住凝胶，轻轻按压，使凝胶粘附在滤纸上。
从底端开始，提起滤纸，将凝胶与纸张一起从玻璃板上取出。将凝胶转移到包装纸之前一样，用真空在 70 摄氏度下干燥一小时，确保在凝胶和烘干机之间使用几个滤纸。将凝胶三明治转移到光漂白的荧光荧光储存盒上，将凝胶的放射性暴露到屏幕上 4 到 16 小时。
最后，将荧光粉存储屏幕放在成像设备上，以中等分辨率扫描约 30 分钟。将聚丙烯酰胺测序凝胶暴露至荧光粉储存屏幕后，一个成功的形状实验显示，凝胶顶部有一个最强烈的弯曲，并且以单核苷酸分辨率弯曲整个凝胶，无需涂抹。凝胶还显示，一些弯曲的强度在小分子的存在下发生变化，表明碱基配对强度的变化。
页面分析中的一个常见问题是，称为盐面的涂片区域可能出现在凝胶的中间，可能是由于加载样品中盐、DMSO 或其他不需要的物质浓度高。这可以通过乙醇沉淀去除不需要的物质来避免。同质RNA模板更可用于体外形状。
我们使用五个质端和三个质端的核糖体来获得这样的RNA。也可以执行细胞内形状，以获得细胞环境中的RNA二级结构。请记住，体外形状可能不会重述体内RNA结合蛋白相互作用。
体外形状是一种强大的方法，用于检测RNA结构中由于存在小分子而发生的变化。这是通过量化逆转录酶停止模式强度的变化。请小心，本视频中描述的所有实验都在经过授权的放射性工作场所进行，并提供适当的个人保护和有机玻璃屏蔽。
