본 비디오는 작은 분자를 표적으로 하는 RNA의 존재에 관심 있는 RNA 서열의 이차 구조를 결정하기 위하여 체외 형상 실험을 위한 상세한 프로토콜을 제공할 것입니다. 체외 형상은 일반적으로 200 미만의 뉴클레오티드인 아미노 크기의 RNA 원소에 대한 각 뉴클레오티드의 역학을 이해하는 비용 효율적인 방법입니다. 원고에 설명된 바와 같이 RNA 템플릿을 준비한 후, 감마 32P ATP를 추가하여 라디오 라벨 리버스 전사 프라이머, 전사 프라이머를 반전시켰다.
10XPNK 반응 완충제, 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 RNA의 자유 수분은 총 20마이크로리터에서 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 들어있습니다. 그런 다음 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 65°C이후 20분 동안 샘플을 활성화한 다음 탈염 컬럼과 원심분리기에서 샘플을 1000회 G.25 마이크로리터2XTBE 샘플 버퍼및 혼합으로 필터링합니다.
10%의 아크릴아미드 젤로 라벨이 부착된 제품을 낮추고 방사능이 상단 저수지로 출혈하지 않도록 하십시오. 젤을 20와트로 1시간 동안 실행합니다. 실행 후, 젤 카세트의 유리 판을 제거합니다.
젤을 플라스틱 랩 조각에 놓습니다. 플라스틱을 젤 상단에 접어 서 꽉 끼는 샌드위치를 만듭니다. 젤 샌드위치를 칼슘 텅스테이트 인광스크린에 놓고 상상의 도구로 노출시다.
젤의 가장자리가 어디에 있는지 알 수있는 일반 빛으로 젤을 다시 이미지. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 두 이미지를 오버레이하고 밝고 어두운 이미지를 오버레이합니다. 그런 다음 두 이미지를 동시에 보려면 상단 이미지를 약간 불투명하게 만듭니다.
인쇄된 이미지가 실제 젤과 동일한 크기인지 확인합니다. 그런 다음 인쇄 된 이미지에 젤을 정렬합니다. 마지막으로, 살균 된 면도날을 사용하여 젤에서 원하는 굴곡을 자르고 각 젤 조각을 별도의 1.7 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 놓습니다.
수동 용용에 의해 젤 슬라이스에서 DNA를 복구하려면 용해 강수량 믹스의 0.3 밀리리터를 각 1.7 밀리리터 튜브에 추가합니다. 16시간 동안 섭씨 4도의 회전기에서 방사성 안전한 용기에 튜브를 배양합니다. 인큐베이션 후 액체를 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 옮킨다.
2.5배 얼음 차가운 200 개의 증거 에탄올을 넣고 튜브를 6 번 반전하여 액체를 섞습니다. 최소 한 시간 동안 영하 80도에서 튜브를 배양합니다. 10, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리한 후, 파이펫팅으로 상체를 조심스럽게 제거합니다.
펠릿을 세척하기 위해 80%에탄올 1밀리리터를 넣습니다. 15초 동안 소용돌이를 가졌고 원심분리기는 같은 조건에서 다시 합니다. 파이펫팅으로 상체를 제거한 후 DNA 펠릿을 5분간 공기 건조시다.
RNA의 무료 물 50 마이크로리터를 넣고 10번 위아래로 배관하여 섞습니다. DNA 농도를 심미경화 카운터에서 마이크로리터당 분당 약 100, 000카운트로 정상화한다. 화학 적 변형을 위한 4개의 견본을 준비하려면, 1.7 밀리리터 미세 원심분리기 관에 0.5 XTE 완충제의 32개의 마이크로리터에 RNA의 8개의 피코몰을 추가합니다.
섭씨 80도에서 2분간 가열하고 얼음 위에서 1분 이상 식힙니다. 그런 다음 5배 접이식 믹스의 8개의 마이크로리터를 추가하고, 이 RNA 혼합물의 9마이크로리터를 각각 4개의 PCR 튜브에 배분하여 1-4로 표시합니다. 10%DMSO의 마이크로리터 1개, 농축 된 소분자 용액 1편을 튜브 2에 넣고, 희석된 소분자 용액 1편을 튜브 3에 넣고 1마이크로리터의 물을 튜브 4에 넣습니다.
모든 PCR 튜브를 37°C의 열 사이클러에 30분 동안 배양합니다. 두 개의 프라임 OH 수정 반응 직전에 DEPC 처리 된 물의 3 마이크로 리터에 두 개의 어금니 NAI 재고 용액의 마이크로 리터 1 개를 희석하여 0.5 어금니 작업 용액을 산출합니다. 즉시 튜브 1, 2 및 3에이 솔루션의 마이크로 리터 를 추가합니다.
튜브 4에 25%DMSO의 마이크로리터 1개를 넣고 15분 동안 섭씨 37도의 열 사이클러에 인큐베이션합니다. 4개의 신선한 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브를 준비하고 용출 강수량 믹스 100마이크로리터와 각 튜브에 글리코겐 2마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이러한 각 튜브로 해당 PCR 튜브에서 모든 액체를 전달합니다.
0.34 밀리리터의 얼음 차가운 200 증거 에탄올을 각 튜브에 넣고 5초 동안 소용돌이를 섞습니다. 튜브를 영하 80도의 냉동고에 적어도 한 시간 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 14, 000배에서 15분 동안 원심분리합니다.
RNA 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에서 상퍼를 제거하십시오. 튜브당 0.5 밀리리터를 넣고 RNA 펠릿과 소용돌이를 15초 동안 세척합니다. 다시 같은 조건에서 원심 분리 후, 상체를 제거하고 5 분 동안 RNA 펠릿을 공기 건조.
혼합하기 위해 10번 위아래로 RNA의 무료 물과 파이프의 9마이크로리터를 추가합니다. 수정된 RNA를 4개의 새로운 PCR 튜브로 옮기고 이전 단계에서와 같이 1~4개의 라벨을 부착합니다. 4개의 추가 PCR 관의 각각에 DEPC 처리된 물의 7개의 마이크로리터에 RNA의 2개의 피코몰을 추가하고 숫자 5-8로 그(것)들을 레이블을 붙입니다.
1~8개의 PCR 튜브에 복구된 방사성 라벨프라이머 2개를 추가합니다. 섭씨 65도에서 5분간 가열한 후, 열 사이클러에서 섭씨 4도까지 즉시 식힙니다. 5x RT 버퍼의 마이크로리터 4개, 어금니 DTT 1개, DNTP 믹스 1개를 각 튜브에 추가합니다.
그런 다음 DEPC 처리 된 물의 마이크로 리터 2 개를 튜브 에 1 ~ 4 개의 튜브를 추가합니다. 5밀리몰러 ddATP의 마이크로리터 4개, 5밀리미터 ddTTP 의 마이크로리터 4개를 튜브에 넣고 6밀리미터 ddCTP의 마이크로리터 4개, 마이크로리터 5개, 마이크로리터 5개, 마이크로리터 3개를 튜브에 넣고 8번, 파이프에 4번 섞어 섞는다. 열 사이클러에서 1 분 동안 52섭씨52도에서 모든 PCR 튜브를 가열한 후 각 튜브에 역 전사제 1 마이크로리터를 넣고 4번 위아래로 파이프하여 혼합합니다.
열 사이클러에서 20 분 동안 섭씨 52도에서 반응을 배양합니다. RNA를 가수분해하려면 각 튜브에 5개의 어금다 나트륨 1마이크로리터를 넣고 5분간 섭씨 95도에서 가열합니다. 그런 다음 1개의 어금음 염산의 5개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중화시키고 이전에 설명한 대로 에탄올 강수량을 반복한다.
DNA 펠릿을 5분 동안 공기 건조한 후 10마이크로리터의 물과 10마이크로리터의 2xTBE 우레아 샘플 적재 버퍼를 1.7 밀리리터 튜브에 넣고 10배 위아래로 파이프하여 재용합니다. 샘플을 섭씨 70도에서 5분간 가열한 다음, 젤에 적재하기 전에 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 얼음 위에 놓인 샘플의 10마이크로리터를 8%의 폴리아크릴아미드 시퀀싱 젤에 적재합니다.
젤을 2시간 동안 65와트로 또는 바닥 염료가 젤의 3/4에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 스페이서를 제거하고 주걱을 부드럽게 삽입하여 상단 실리콘 유리 판을 제거합니다. 큰 필터 용지로 젤을 덮고 부드럽게 눌러 젤이 필터 용지에 부착되도록 합니다.
하단 끝에서 시작하여 필터 용지를 들어 올리고 용지와 함께 유리 플레이트에서 젤을 제거합니다. 이전에 수행된 것처럼 젤을 래핑 페이퍼로 옮은 후 진공 상태에서 1시간 동안 섭씨 70도에서 건조하여 젤과 건조기 사이에 여러 개의 필터 용지를 사용해야 합니다. 젤 샌드위치를 사진 표백 형 인광 저장 화면 카세트에 옮기고 젤의 방사능을 4 ~ 16 시간 동안 화면에 노출시하십시오.
마지막으로, 이미징 장치에 인광저장 화면을 놓고 중간 해상도로 약 30분간 스캔합니다. 포광 저장 스크린에 폴리아크릴아미드 시퀀싱 젤을 노출한 후, 성공적인 형상 실험은 겔 의 상단에 하나 및 가장 강렬한 굴곡을 보여주었으며, 얼룩없이 단일 뉴클레오티드 해상도에서 겔 전체에 걸쳐 굴곡하였다. 젤은 또한 몇몇 굴곡의 강렬이 작은 분자의 존재에서 변경된다는 것을 보여주었습니다, 염기 페어링 강도의 변경을 표시하.
페이지 분석에서 일반적인 문제점은 소금 전면으로 알려진 얼룩 영역이 겔 의 중간에 나타날 수 있다는 것입니다, 아마도 로딩 샘플에서 염, DMSO 또는 다른 원치 않는 물질의 높은 농도 로 인해. 그것은 에탄올 강수량에 의해 원치 않는 물질을 제거하여 피할 수 있습니다. 균질RNA 템플릿은 체외 형상에 바람직하다.
우리는 이러한 RNA를 얻기 위해 5 개의 프라임 및 3 개의 주요 끝에서 리보솜을 사용합니다. 세포 내 형상은 또한 세포 맥락에서 RNA 이차 구조를 얻기 위해 수행될 수 있다. 기억, 체 외 모양 생체 RNA 바인딩 단백질 상호 작용에서 recapitulate 하지 않을 수 있습니다.
체외 형상은 작은 분자의 존재로 인해 RNA 구조의 변화를 검출하는 강력한 방법입니다. 이는 역실제 정지의 패터닝 강도의 변화를 정량화하여 수행됩니다. 이 비디오에 설명된 모든 실험은 적절한 개인 보호 및 플렉시 유리 차폐를 가진 공인 방사성 작업장에서 수행되어야합니다.
