进行猪胰腺移植的手术技巧和窍门

该视频文章总结了猪3天生存模型中的胰腺切除术和胰腺同种异体移植技术，并逐步描述了该方法，并强调了处理不稳定和精细的猪内脏解剖结构的手术技巧和窍门。

尽管胰腺移植在1型糖尿病和代谢综合征中取得了有希望的结果，但围绕这种最先进技术的最大担忧仍然是缺乏被认为适合移植的器官。与肝脏和肾脏等器官相比，高血管内阻力、脆弱的实质内毛细血管框架和肠系膜脉管系统周围的复杂小叶解剖结构使该器官更容易受伤，对轻微创伤的耐受性更低。细致的手术解剖和明智的组织处理构成了整个胰腺移植工作的基石。由于与人体解剖结构相比，猪胰腺与周围肠系膜血管和器官的解剖结构在形态学上相似，因此在猪模型中演示该技术有助于最准确地将其推断为人类环境。本文旨在概述需要遵循的基本手术技巧和窍门，以确保在猪3天生存模型中移植这种高度敏感的器官的成功率更高。

在过去的几十年中，围手术期管理策略和手术技术取得了重大进展，导致胰腺移植发展成为治疗糖尿病伴终末期肾病（通常与肾移植联合使用）的最有希望的策略之一¹.然而，移植物胰腺炎、缺血再灌注损伤和血管血栓形成等并发症仍然是确保成功结局需要克服的最大挑战，在受损更大的扩展标准移植物²中更是如此。此外，胰腺移植物是采购中最常丢弃的移植物，对^{任何器官的}利用率最低（9%）3。因此，机器灌注旨在为胰腺移植物提供最佳的稳态环境，目的是提高移植物利用率，类似于在肝、肾和肺移植中取得的^成就4。猪胰腺解剖结构复杂，包括其小叶结构（包括三个叶），围绕肠系膜门轴的延伸，肠系膜血管变化（40%-50%），以及沿十二指肠C环的细腻血管通道^5。这些解剖学属性有助于在提取胰十二指肠移植物和受者胰腺切除术中具有挑战性的夹层，以诱导医源性胰腺糖尿病状态，即手术诱导的糖尿病状态，空腹血糖水平高于 8 mmol/L。 基于这些特征，猪胰腺切除术联合移植提供了该技术的最接近的复制，该技术可以在人类中进行，作为针对终末期的确定性治疗方法。 糖尿病。本文旨在涵盖以下几个方面:（i）受者胰腺切除术和胰腺移植植入期间围手术期猪护理概述;（ii）受者胰腺切除术和胰十二指肠移植物植入的技术步骤细节，以及（iii）猪模型中供体和受体胰腺手术的提示和技巧，以尽量减少移植物和受体损伤。

该协议获得了多伦多综合研究所动物护理委员会的伦理批准。动物根据加拿大安大略省国家卫生研究院（NIH）的国家医学研究学会和实验动物护理指南接受了人道护理。在这项研究中，使用了15周龄的无血缘关系的约克郡公猪，体重为40-50公斤。

注:整个研究方案分为以下主要步骤:（i）器官取回和背台准备;（二）受者全胰腺切除术和（三）移植物植入术。供体和受体的整个手术在1天内完成。

1. 供体器官取回和背台准备

注意:器官取回方法已在单独的协议⁶中描述。然而，这里简要地描述了该方案以及一些特定于手术技术的额外要点（与供体手术相关的手术技巧）。

1. 简而言之，麻醉供体猪，并固定气道和中心静脉导管（在下文受者胰腺切除术部分描述）。切开并暴露内脏。进行主动脉腔夹层和活动，直至分叉成髂血管。
2. 肠道处理:猪小肠长而曲折，大肠多为扩张。确保在供体手术的每一步后将肠袢重新定位在其解剖位置，以确保足够的灌注并避免肠系膜扭转的可能性。
3. 肺门清扫术:结扎并分割动脉分支和胆管，露出门静脉。尽可能高/远端解剖肺门（肝十二指肠韧带），以避免损伤灌注胰十二指肠上侧的小血管通道的风险。开始以从右到左的顺序对血管进行骨骼化，直到门静脉的前表面裸露。
4. 主动脉瓣夹层:通过分割膈肌来暴露主动脉的肝上膈下部分。避免解剖胰十二指肠树丛周围的下腔静脉。使用两侧的肾动脉作为夹层的标记上限。
5. 通过打开小囊暴露胰腺。结扎和分裂肾动脉。插管肾下主动脉并与威斯康星大学 （UW） 溶液连接以进行冲洗。
6. 结扎肝上主动脉并夹住。用 1.5 L-2 L UW 溶液冲洗，以确保肠道和胰腺充分冲洗（从苍白的视觉外观上明显看出）。在器官原 位 冲洗期间，将小肠和大肠依次重新定位到中线，确保没有肠系膜扭曲。此步骤可确保使用UW（威斯康星大学）溶液均匀冲洗肠道和胰腺，并且记住这一点很重要。
7. 开始冲洗后同时切开门静脉和肝下腔静脉，以排出静脉流出物。用冰块覆盖腹部以确保冷灌注。 集体解剖器官（胰十二指肠移植物，腹膜后、腰大肌、脾脏和肾上腺部分）。
8. 冷夹层:通过尖锐解剖胰腺和大肠之间的筋膜，开始从外侧向到内侧方向，从胰尾到头部和体之间的交界处移动移植物。在执行此步骤时，用镊子握住胰腺的腹膜后覆盖物，并要求助手对大肠朝向脚部进行反牵引。
9. 肠系膜钳夹:将胰腺体、十二指肠空肠袢和大肠周围的薄组织分开后，请助手绕着肠系膜蒂转圈，向尾部拉动大肠袢。这将确保系膜的描绘和安全夹具的放置，以按顺序划分肠系膜大血管，而不会损伤胰腺实质。
10. 移植物的完全腹膜外清扫:分离肠系膜血管后，开始逆时针方向从内侧到外侧夹层取回移植物，分离胰腺外组织，包括肾旁筋膜、肾上腺、IVC 袖带、腰肌和膈肌结节。确保有足够的平面远离主动脉，以避免损伤肠系膜上动脉和乳糜泻动脉。
11. 在冰上进行背台准备。将器官储存在冰盒中（冷缺血时间为5小时）。

2. 受者胰腺切除术

1. 术前准备
   1. 在规定的诱导时间之前将动物禁食至少6小时。在将动物运送到手术室（OR）之前15分钟，皮下注射含有咪达唑仑（0.15mg / kg），阿托品（0.04mg / kg）和氯胺酮（25mg / kg）的注射剂。在转运到OR前15分钟给予丁丙诺啡0.3mg缓释注射SC。
   2. 定位:将动物仰卧放在手术台上并驾驭前肢以确保手术过程中的位置稳定。
   3. 气道和诱导:使用袋子和面罩每分钟用3%-5%异氟醚和2-3升氧气给动物通风，同时连接脉搏血氧仪探头并监测心率和O₂ 饱和度。
   4. 充分放松后，通过松弛下颌和稳定的氧饱和度和心率确认，要求助手张开嘴巴，对动物放松的上下颌有足够的牵引力，并使用喉镜观察声带。喷洒2%利多卡因以放松声带，以防止插管引起的痉挛（猪声带高度血管化且脆弱！
   5. 使用 7 mm 气管插管，并使用 3-5 mL 空气给袖带充气。使用潮气末 CO₂ （ETCO₂） 探头确保管子的位置，并将管子连接到呼吸机，每分钟呼吸 14-16 次，以实现 10-15 mL/kg 的潮气量。将异氟醚降低至2.5%作为吸入麻醉的维持剂量。
   6. 静脉注射:用甜菜碱无菌准备手术部位并放置无菌窗帘。然后，确定放置中心静脉导管的标志，中心静脉导管是乳突、肩峰突和锁骨头之间形成的三角形的质心。使用 16 G 针刺穿静脉;在确保静脉血液自由流动后，通过颜色和缺乏脉动性明显，使用Seldinger技术引入导丝。
   7. 使用提供的扩张器扩张尿道。用 8.5 x 10 Fr 导管更换导丝和扩张器，并通过用 0-0 丝线切割针缝合固定到位。将静脉输液管连接到含有头孢唑啉（1 g）和甲硝唑（500 mg）的静脉注射抗生素，然后以 10 mL/h 的速度通过丙泊酚输注进行静脉麻醉。
   8. 有创血压监测:用βdine无菌准备手术部位后，放置无菌窗帘，并在距中线2厘米处平行于气管的切口。通过使用Lahey直角钳和止血钳进行钝性解剖，解剖胸骨瘤样肌和气管旁筋膜的纤维。
   9. 识别肩带肌肉纤维的颈静脉外侧，并如上所述使用钝性夹层沿肌肉将其与颈动脉内侧隔开。通过动脉的脉动、质地（脊髓样）和血管周围丛来识别动脉。调动容器并使用两条真丝 2-0 领带将其吊起。
   10. 用 16 G 血管导管刺穿血管，斜面尖端朝上，并在血管内取出内探针。使用Seldinger技术滑动外导管鞘，并将出口连接到动脉血压（BP）测量系统。在连接有创血压监护仪之前，将读数校准为零以确保准确记录并使用丝带将导管固定到位。
   11. 温度监测和加热:将温度记录探头口服。用Bair-hugger加热羽绒被盖住动物，并确保温度为37-38°C。 用中性眼部润滑凝胶润滑眼睛。粉刷和悬垂手术区域
2. 手术
   注意:使用βdine磨砂膏对所有外科手术进行无菌准备，然后放置无菌窗帘。
   1. 切口和曝光:使用牛电烙术的纯切割模式从剑胸骨到耻骨联合做一个中线切口。确保在以外的切口下部保持尿道外侧，以避免受伤。放置自保留腹壁牵开器注意不要损伤脾脏和肝脏，以优化手术区域的暴露。
   2. 胰头的活动:助手为胰十二指肠小树林提供反牵引力，首先沿着胰实质（十二指肠叶）和肝下IVC之间的无血管筋膜平面进行解剖。
   3. 胰环动员:猪胰腺围绕肠系膜门轴（连接叶）形成环。沿门静脉 （PV） 两侧的筋膜解剖，以确保连接叶从上覆的 PV 完全移动。最安全的方法是沿着门静脉的任一侧开始解剖，并顺时针或逆时针方向沿圆周分离组织。
   4. 胰尾动员:接下来，确定胰腺和肾旁组织之间的连接处（显示为白线），并开始从靠近实质的下层脾静脉上解剖尾巴。结扎并分隔小静脉支流到实质，注意不要使用丝绸 3/0 系带损伤脾静脉。
   5. 胰腺体动员:沿着将实质与大肠和胃分开的薄组织层解剖，注意沿幽门下区域保留薄血管弓。
   6. 胰-十二指肠动员:接下来，通过牵引-反向牵引在胰十二指肠小树林中通过尖锐的解剖将实质与十二指肠的 C 环分开，注意沿十二指肠 C 环保留薄血管弓。
   7. 胰管的划分:识别胰管，用丝绸 2-0 领带结扎，并在十二指肠 C 环上保持导管残端约 3-5 毫米，远离十二指肠血管弓（与导管密切相关）。
   8. 取出标本:通过从门静脉两侧的连接叶、十二指肠和结肠之间的交界处解剖实质来完成活动的最后一部分。通过在PV的前侧面划分连接叶来整体提取样品（图1）。需要分割实质才能将标本提取出来，因为它的圆周位置围绕PV。
   9. 确保沿夹层区域止血，并检查十二指肠是否有任何损伤和血管充血（图2）。
3. 胰十二指肠移植物的植入
   1. 移植物的准备:通过修剪吻合边缘来准备移植物PV和主动脉近端。将准备好的移植物放入装有UW溶液的器官袋中，放在冰浴上。从胰尾进行核心针活检 - 储存在福尔马林中，快速冷冻，并在稍后阶段提取RNA。使用Prolene 6-0以8的图形方式缝合活检部位。
   2. 主动脉腔夹层:首先确定右侧输尿管，并沿筋膜进行解剖，将输尿管与下腔静脉上的腹膜后覆盖物分开。沿主动脉外侧缘解剖，使其与下面的腰肌暴露。接下来，沿着主动脉腔间小树林解剖，将主动脉与IVC分开。
   3. 钳夹试验:通过试验Satinsky血管钳夹放置，确保主动脉和IVC充分活动。与第一助手切换位置，并通过缩回左侧的肠袢来准备手术区域，以暴露主要血管以进行吻合。将试验夹放在IVC和主动脉上，以重新评估两个血管的充分动员以进行吻合。
   4. 静脉吻合术:将血管侧咬夹放入IVC后，在血管前壁开一个小口，并使用Pott的剪刀将其伸展到适当的尺寸（与移植血管相匹配）。使用静脉插管的柔性鞘用肝素化盐水冲洗管腔。
   5. 使用Prolene 6-0双针，在IVC（由内而外）和移植门静脉（由内而外）上进行角缝合。固定尾角缝合线，并沿移植物和受体静脉的后壁连续运行其中一根针。以类似（由外向内连续）的方式固定前壁，并在用肝素化盐水冲洗吻合腔后将结固定在前壁中心。
   6. 解夹静脉:将斗牛犬的血管夹放在移植物门静脉上，远离吻合口，然后慢慢从受体IVC中释放侧咬钳。检查静脉再充盈和吻合口是否有大出血。
   7. 动脉吻合术:将侧咬夹放在主动脉上，注意不要损伤沿血管后内侧壁的腰支。指导麻醉师通过中心静脉导管注射肝素（100U/kg BW）和甲泼尼龙（500mg）。
   8. 在血管前壁上开一个口，并向颅骨和尾部延伸，注意不要沿着血管壁解剖。用肝素化盐水冲洗管腔并使用Prolene 6-0双针，通过降落伞技术以连续的方式将移植主动脉的近端缝合到受体主动脉开口。用肝素化盐水冲洗管腔，然后将最后一个结绑在血管前壁上。
   9. 再灌注:在执行此步骤时注意以下两个方面。首先，平均血压急剧下降的血流动力学改变。每分钟监测有创血压，并调整血管加压药（去甲肾上腺素输注）的剂量调整和液体前负荷，以将目标平均血压保持在 45-50 mmHg 之间。
   10. 第二，保持止血。从静脉中取出斗牛犬夹后，评估实质、主动脉旁区域和门脉周围区域是否有任何大出血;然后，松开主动脉钳夹并检查动脉吻合口部位是否有出血。用结扎和止血缝合固定出血点。要求麻醉师通过中心静脉导管注射一瓶氨甲环酸。
       注意:一个重要的规则是在再灌注的这个阶段尽量减少对胰腺的积极处理（以避免移植物水肿和血肿）。
   11. 肠吻合术:在确保无肠系膜扭转后，隔离一圈空肠，距离十二指肠交界处40-50厘米，并使其靠近移植物。使用聚二恶烷酮4-0缝合线以左右连续的方式将十二指肠移植到受体空肠上，注意确保足够的管腔直径为1.5-2cm。
   12. 止血和再灌注后活检:确保移植物周围和吻合部位止血。在福尔马林再灌注储存后1小时从胰尾取三个核心针活检，快速冷冻，并在稍后阶段提取RNA。用Prolene 6-0以8的图形缝合活检部位。
   13. 腹壁闭合:在评估拖把滞留并确保止血后，使用聚二恶烷酮 0 针连续缝合腹直肌，注意中下线，远离尿道。使用丝0缝合线连续闭合皮肤。
       注意:理想情况下，建议使用单丝缝合线（尼龙）;然而，由于这是一个 3 天的生存模型，丝绸在这些实验模型中是可以接受的。
   14. 绑扎中心静脉导管:在颈部建立皮下隧道，并通过将其埋在隧道下方并用丝绸 0-0 切割针缝合上覆皮肤来固定中心静脉导管。
   15. 移除动脉导管:在确保血气分析的平均血压稳定（40-50 mmHg）以及pH和乳酸水平的改善趋势后，移除动脉导管并结扎血管以确保颈部止血。用丝绸0缝合线连续闭合覆盖的皮肤。
   16. 定位动物和拔管:在所有必要的预防措施下，将动物胸骨放在运输车上。观察 O 2 饱和和麻醉逆转（四肢运动、自主呼吸努力、SpO 2 >95% 关闭 O_{2 和}呼吸机支持）并拔管动物。运输到围栏并定位动物胸骨并监测血流动力学状态直至稳定。

图1: 集体切除的胰腺切除标本。 注意 体内门静脉周围的胰腺组织环。 请点击此处查看此图的大图。

图2:十二指肠的图像。 十二指肠的 C 环与保留的血管弓（箭头）与周围的空肠环进行比较，并评估充血情况。 请点击此处查看此图的大图。

下面总结了五种胰腺移植生存模型的围手术期和术后长达 3 天的生化参数（按年表编号为 PTX 1 至 5）。在五例胰腺移植中，所有胰腺移植在3天生存期内都表现良好，这从其总体健康状况以及胰腺损伤和内分泌功能测试中可见一斑。下面描述的结果代表了受者胰腺切除术的3天生存模型的经验，然后在移植物静态冷藏后进行胰腺同种异体移植。

胰腺切除术的平均手术时间为52分钟（45-64分钟）。由于这是一个脑死亡的心脏跳动模型，供体中没有心脏停搏性温暖缺血期。从应用侧咬腔钳到移植物再灌注的平均受体温暖缺血时间为49.5分钟（40-55分钟）。根据研究方案，所有五个移植物的冷缺血时间为5小时（300分钟）。所有动物每天两次接受300mg Syp环孢菌素形式的免疫抑制。

围手术期临床生化参数
再灌注后1小时的平均心率为135次/分钟（120-170次/分钟）。平均血压为37毫米汞柱（30-55毫米汞柱），通常在高剂量去甲肾上腺素输注的掩护下维持。在所有五种情况下，去甲肾上腺素都可以逐渐减少并停止使用，然后再将动物移回围栏。再灌注后在手术室监测乳酸水平3小时。趋势如图 3 所示。

图3:移植物再灌注后的血清乳酸水平。 测量再灌注前3小时的趋势。Y 轴表示乳酸值（以毫摩尔/升为单位）。 请点击此处查看此图的大图。

术后临床及胰腺损伤生化参数
所有五只动物在再灌注后5-6小时内均具有临床警觉性，通过四肢和呼吸模式的积极运动而明显。他们都是活跃的，接受口服喂养和药物，并在术后第1天的早晨排出尿液和粪便。

前3天的术后淀粉酶水平总结于 图4。

图4:移植物再灌注后的血清淀粉酶水平。 在移植后的前3天测量趋势。Y 轴表示淀粉酶水平 （U/L）。 请点击此处查看此图的大图。

前3天的术后血清脂肪酶水平总结于 图5。

图5:移植物再灌注后的血清脂肪酶水平。 在移植后的前3天测量趋势。Y 轴代表脂肪酶水平 （U/L）。 请点击此处查看此图的大图。

术后血清乳酸脱氢酶（LDH）水平总结于下面的 图6中。

图 6:移植物再灌注后的血清 LDH 水平。 在移植后的前3天测量趋势。Y 轴表示 LDH 水平 （U/L）。 请点击此处查看此图的大图。

术后葡萄糖耐量试验
术后第三天进行120分钟静脉葡萄糖耐量试验。通过中心静脉导管注射含有50%葡萄糖的50mL剂量，并将时间记录为0分钟。随后在2分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，60分钟，90分钟和120分钟提取血液样品，并处理葡萄糖水平。将样品的其余部分以8，000× g 离心10分钟，并将上清液储存在-80°C的三个微量离心管中。 图7 显示了五种病例的葡萄糖耐量测试趋势（PTX 1-5）。

图 7:通过静脉葡萄糖耐量试验评估的血清葡萄糖水平。 使用IV葡萄糖耐量试验评估血清葡萄糖水平0-120分钟，并在PTX 1-5之间进行比较。Y 轴代表葡萄糖水平 （mmol/L）。 请点击此处查看此图的大图。

目前的方案已经用于证明在猪模型中进行胰腺切除术和胰腺同种异体移植的技术和可行性。在移植后观察动物3天，以证明胰腺切除术和同种异体移植技术的可靠性。所有动物在手术后使用抗生素、液体、镇痛药、补充营养和免疫抑制剂（即环孢素）的标准化动物护理方案进行监测和护理 3 天。在术后第三天（72小时后或更早，如果临床恶化而要求）通过道德认可的人道技术处死。从尾部、体、头部和十二指肠取活检并送去进行组织病理学分析，其余切片储存在RNA分离缓冲液中，快速冷冻（-80°C）以备后用。

柴巴等人于2011年在10头体重27-33^公斤的白人公猪中发表了通过胰腺切除术成功证明猪模型中医源性糖尿病的最早尝试之一7。该小组展示了解剖平面和地标，为猪模型中成功的胰腺切除术建立了路线图。Prudhomme等人在2020年证明了糖尿病诱导和胰腺同种异体移植在他们的三头雄性Susscrofa猪队列中的可行性⁸。通过全胰腺切除术后3小时的C肽水平评估糖尿病的诱导。Grussner等人于1993年成功地证明了约克郡猪糖尿病的医学诱导，在67头约克郡地方品种猪的队列中死亡率为0%⁹.2022 年，我们的小组（Mazilescu 等人）在动物的临床健康状况指导下，使用血清葡萄糖水平评估了胰腺切除术成功诱导糖尿病的情况¹⁰.在成功诱导后，我们小组在方案的后续阶段进行了胰腺切除术后的胰腺同种异体移植。

该研究的一个重要局限性是确保所有动物队列的统一可复制性。这主要是因为猪模型在易患季节性流感、人畜共患病等方面具有脆弱性。这些因素可能会导致结果的负面扭曲，无论用于手术的技术如何。

影响胰腺移植结局的因素包括术前状况，如总体健康状况、心肺状态、季节性感染和围手术期状况，如机器灌注结束时的移植物状态、手术期间的移植物处理、再灌注时的血流动力学改变¹¹。从外科手术的角度来看，尽量减少体内和非原位移植物处理在确保在这种高度不稳定的移植模型中植入损伤最小的移植物方面起着重要作用¹²。机器灌注过程中灌注液成分、透析液和生理参数的改变也可能决定移植的结果，目前正在由该小组进行评估。在机器灌注移植物中建立成功的同种异体移植模型，可以进一步为未来心源死亡后捐献（DCD）和胰腺延长冷藏（ECS）等扩展标准移植铺平道路。

作者没有利益冲突需要披露。

没有。