تستخدم مسببات الأمراض البكتيرية عوامل الفوعة لاستعمار منافذ مختلفة داخل الكائن الحي المضيف. نحن نعمل على فهم كيفية استشعار مسببات الأمراض البكتيرية لإشارات بيئية محددة في الأنسجة المضيفة لتنظيم تعبير عامل الضواعة. يستخدم العامل الممرض البشري Yersinia pseudotuberculosis عامل ضراوة نظام الإفراز من النوع الثالث لحقن البروتينات المستجيبة في الخلايا المضيفة.
يسمح نظام الإفراز من النوع الثالث للبكتيريا بتخريب آليات دفاع المضيف واستعمار الأنسجة المضيفة. ومع ذلك ، فإن التعبير عن نظام إفراز Yersinia من النوع الثالث مرهق من الناحية الأيضية ، لذلك يتم تنظيم التعبير عن جينات نظام الإفراز من النوع الثالث بشكل صارم استجابة للإشارات البيئية مثل درجة الحرارة. أظهرت منشوراتنا السابقة أن التعبير عن نظام إفراز اليرسينيا من النوع الثالث يتم التحكم فيه من خلال توافر الحديد وتوتر الأكسجين من خلال عامل نسخ يسمى ISCR.
هذه النتائج مهمة لأن يرسينيا تستعمر الأنسجة المضيفة التي تختلف في محتواها من الحديد وتوتر الأكسجين. على سبيل المثال ، يحتوي تجويف الأمعاء على ما يكفي من الحديد لنمو اليرسينيا ولكن لديه توتر أكسجين منخفض. في المقابل ، تحتوي الأنسجة مثل الدم على توافر منخفض جدا للحديد ولكن توتر أكسجين أعلى.
تسمح لنا طريقتنا بزراعة اليرسينيا في ظروف الاستزراع التي تختلف في كمية الحديد والأكسجين المتاحين ، لدراسة كيفية تأثير هذه الإشارات البيئية على التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث. ستساعدنا هذه الطريقة في تحديد الآلية الجزيئية التي يتحكم من خلالها توافر الحديد والأكسجين في التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث ، وتساعدنا على فهم كيفية تحكم ذلك في نتيجة عدوى اليرسينيا. للبدء ، قم برسم Yersinia السل الزائف على ألواح أجار مرق Lysogeny.
احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة. بمجرد تشكيل مستعمرات مرئية ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة معزولة في أربعة ملليلتر من وسائط M9. زراعته بين عشية وضحاها عند 26 درجة مئوية مع تهوية عند 250 دورة في الدقيقة.
ضع كوفيت يحتوي على المزرعة في مقياس طيف ، ثم قم بتخفيف المزرعة في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة بدون مكملات الحديد لتحقيق قيمة OD600 تبلغ 0.1. ضع القوارير في شاكر 26 درجة مئوية واحتضانها لمدة ثماني ساعات. بعد اكتمال الحضانة ، استخدم الثقافة لبدء ثلاث ثقافات جديدة. اثنان للنمو اللاهوائي وواحد للنمو الهوائي.
للزراعة الهوائية ، قم بتخفيف المزرعة إلى قيمة OD600 بقيمة 0.1 في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة دون مكملات الحديد. ثم استزراع التهوية عند 26 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. للزراعة اللاهوائية ، قم بتخفيف الثقافة في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة إلى أنبوبين زجاجيين مغسولين بالحمض.
في الأنبوب الأول ، أضف كبريتات الحديد المعقمة بالترشيح إلى التركيز النهائي البالغ ملليغرام واحد لكل لتر. في الأنبوب الثاني ، أضف كبريتات الحديد للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 ملليغرام لكل لتر. احتضان كلا الأنبوبين في غرفة لاهوائية في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
بعد ذلك ، قم بتحفيز نشاط نظام الإفراز من النوع الثالث عن طريق تحويل المزارع اللاهوائية إلى 37 درجة مئوية ، واستمرار الحضانة لمدة أربع ساعات. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافات التي تنمو هوائية إلى قيمة OD600 البالغة 0.2 عن طريق إضافة 14 مل من وسائط M9 المخلبة إلى قارورتين مغسولتين بالحمض. أضف كبريتات الحديد بالتركيزات النهائية المطلوبة إلى القوارير.
احتضان كلا القواريرتين بالتهوية عند 26 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، قم بتحويل الثقافات إلى 37 درجة مئوية مع تهوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات للحث على نشاط نظام الإفراز من النوع الثالث. بعد تحفيز نظام الإفراز من النوع الثالث في Yersinia pseudotuberculosis ، قم بنقل الأحجام الطبيعية لهذه الثقافة المحتضنة إلى أنابيب سعة 15 ملليلترا.
أضف أربعة ميكرولترات من ألبومين مصل الأبقار إلى كل أنبوب للتحكم في ترسيب البروتين. الطرد المركزي للثقافات عند 3 ، 200 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بتصفية المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر باستخدام مرشح PVDF 0.22 ميكرون متصل بحقنة.
ثم أضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ما يعادل 10٪ من حجم المادة الطافية. دوامة الأنابيب بقوة لمدة دقيقة واحدة. احتضان الأنابيب على الجليد في غرفة باردة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
بعد ذلك ، أضف ملليلترين من كل عينة إلى أنبوب سعة ملليلترين ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 21 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. شفط المادة الطافية باستخدام ملحق فراغ. كرر سحب ملليلترين من العينة إلى نفس الأنبوب ، وجهاز الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية.
دمج تفاعلات هطول الأمطار في أنبوب واحد سعة ملليلتر. اغسل الكريات بملليلتر واحد من الأسيتون المثلج 100٪ متبوعا بالطرد المركزي وشفط المادة الطافية. بعد إزالة المادة الطافية للمرة الأخيرة ، جفف الحبيبات على المقعد لمدة ساعة واحدة.
يجب أن يبدو البروتين المترسب مثل الضباب على طول جانب الأنبوب. ثم, أعد تعليق كل حبيبات في 50 ميكرولتر من محلول F-S-B-DTT. دوامة جيدا لمدة دقيقة واحدة.
بعد ذلك ، قم بغلي العينات على كتلة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم ، جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل 15 ميكرولترا من كل عينة لاهوائية و 10 ميكرولتر من كل عينة هوائية إلى جل SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ للتحليل.
بعد اكتمال تشغيل الجل ، استخدم تلطيخ الفضة لتصور البروتينات على الجل. للبدء ، ضع جل SDS-PAGE يحتوي على عينات هوائية منفصلة من مرض اليرسينيا الكاذب في نظام التصوير. في البرنامج ، حدد النطاقات التي تمثل بروتين مستجيب نظام الإفراز من النوع الثالث ، YopE ، عبر جميع الآبار.
اضبط نطاق YopE المرجعي على العينة المناسبة. تصدير قيم القياس الكمي النسبي المحسوبة بواسطة البرنامج لجميع نطاقات YopE. ثم حدد جميع نطاقات BSA عبر جميع الآبار.
تأكد من تطابق نطاق BSA المرجعي مع عينة نطاق YopE المرجعي. تصدير قيم القياس الكمي النسبية لجميع نطاقات BSA. اقسم قيمة YopE على قيمة BSA لكل شرط لإنتاج نتائج طبيعية.
كشف جل SDS-PAGE الملون بالفضة أنه في العينات اللاهوائية ، كان هناك 38 ضعفا من YopE في عينات الحديد المنخفضة مقارنة بعينات الحديد العالية. في العينات الهوائية ، تم إفراز هذه البروتينات بكميات متشابهة تقريبا.
