يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ملف تعريف متعدد يكشف عن تفاصيل جزيئية حول نشاط الريبوسومات داخل الخلية. تسمح هذه التقنية للمستخدمين بالحصول على المعلومات القيمة التي يوفرها ملف تعريف متعدد الأضلاع ، والذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى أنظمة تجزئة التدرج الآلي. خذ وقتك أثناء إعداد التدرجات ، وقم بتخزين التدرجات في مكان لن يتم تعطيلها بواسطة ضاغط أو عمليات ميكانيكية أخرى أثناء استقرارها في تدرج خطي.
للبدء ، قم بإعداد محاليل المخزون من 7 و 47٪ من السكروز في المخزن المؤقت لتدرج السكروز. مرشح تعقيم حلول مخزون السكروز من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تحضير 14 ملليلتر من حلول السكروز 17 و 27 و 37 ٪ عن طريق توزيع وخلط محاليل المخزون 7 و 47 ٪.
ضع ستة أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين في رف أنبوب اختبار الرؤية الكاملة. تأكد من وجود مساحة كافية بين الأنابيب بحيث لا تزعج الإجراءات مع أنبوب واحد الآخرين. قم بتوصيل إبرة قياس تسع بوصات و 22 بوصة مع طرف حاد بحقنة سعة ثلاثة ملليلتر ، وقم بإجراء تعبئة اختبار وتوزيعها للتأكد من أن المحقنة يمكنها الاحتفاظ بمحلول السكروز دون أي تنقيط قبل إعداد التدرجات.
أضف ملليلترين من السكروز 7٪ إلى الجزء السفلي من كل أنبوب طرد مركزي. ثم ، أضف ملليلترين من السكروز 17٪ تحت محلول 7٪ ، عن طريق وضع طرف الإبرة داخل المنطقة المجاورة مباشرة لقاع الأنبوب. بعناية وببطء الاستغناء عن الحل.
كرر الإجراء بمليلترين لكل من محلول السكروز 27 و 37 و 47٪ ، مما يضمن أن كل طبقة يمكن تمييزها عن الأخرى بواسطة خط يشير إلى فصل الكثافات. قم بتخزين التدرجات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها للسماح لها بالاستقرار في نسبة مستمرة ومتزايدة من السكروز. بعد نمو وحصاد الخميرة ، تقوم خلايا Saccharomyces cerevisiae بإعادة تعليق الخلايا في 700 ميكرولتر مبردة من مخزن استخراج polysome.
أضف 100 وحدة من مثبط الحمض النووي الريبي. ثم أضف 400 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المبرد مسبقا بحجم تقريبي يتراوح من 425 إلى 600 ميكرون. انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر مع الخرز الزجاجي ، وقم بتعطيل خلايا الخميرة عن طريق التحريض القوي في مضرب الخرز لمدة خمس دقائق.
بعد تعطيل الخلايا ، قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي. حدد تركيز الحمض النووي الريبي في الليزات الواضحة عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر، باستخدام نظام الكشف عن الحمض النووي الريبي القائم على التألق. تأكد من أن تركيز الحمض النووي الريبي هو 0.5 إلى ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.
إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفضا جدا ، فقم بتقليل حجم المخزن المؤقت للاستخراج المستخدم لإعادة تعليق الخلايا. قم بتحميل الليزات بعناية على الجزء العلوي من التدرجات. ضع طرف الماصة على الجدار الداخلي في الجزء العلوي من أنبوب البولي بروبلين.
قم بزاوية الأنبوب وقم بتوزيع الليزات ببطء على الجزء العلوي من التدرج ، والمراوغة على الحائط. ضع الأنابيب برفق في الجرافات المبردة مسبقا لدوار الجرافة المتأرجح ، وقم بالطرد المركزي للتدرجات. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة أنابيب أجهزة الطرد المركزي بعناية من دوار الدلو المتأرجح ، وضعها في حامل الأنبوب.
قم بتسمية الألواح المكونة من 96 بئرا لتخزين الكسور وتبريدها مسبقا على الجليد. اجمع 100 أو 200 ميكرولتر من الكسور بدءا من أعلى التدرج ، عن طريق إدخال طرف ماصة بعناية في الجزء العلوي من التدرج ، وجمع الكسور حتى يتم اقتباس التدرج بأكمله. قم بقياس امتصاص كل جزء عند 254 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي مقابل محاليل السكروز 7 و 47٪ كفراغات.
قم بإنشاء ملف تعريف متعدد الأضلاع عن طريق رسم رقم الكسر مقابل الامتصاص. يتم عرض ثلاثة ملامح متعددة التمثيل من الخميرة S.Cerevisiae. قمة كل وحدة فرعية ريبوسومية وقمة متعددة الصبغيات واضحة على كل ملف تعريف.
يتم عرض ملف تعريف تمثيلي من نظام تجزئة الكثافة الآلي هنا. تم إنتاج هذا الملف الشخصي من ملف تعريف امتصاص مستمر حيث تم إزاحة تدرج السكروز من الأسفل إلى الأعلى بواسطة محلول مطاردة ، من خلال خلية تدفق كاشف وتم جمعها في كسور. يتم عرض ملف تعريف polysome الناتج عن تجزئة عينات 200 و 100 ميكرولتر يدويا هنا.
أهم شيء يجب تذكره مع هذا الإجراء هو عدم تعطيل التدرجات. احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء أو تعطيل التدرج عن طريق توزيع المحلول بسرعة كبيرة. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من التدرجات لمزيد من التحليل لتحديد الحمض النووي الريبي المرسال الذي يرتبط بالريبوسومات النشطة
