Name: an easy method for plant polysome profiling
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Easy Method for Plant Polysome Profiling at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (وكالة الاستخبارات الوطنية-14-CE02-0010). نشكر الدكتور بنيامين الميدان والدكتور إيلودي Lanet لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر السيد ميشيل تيريز لمساعدته مع تحرير الفيديو.

1. إعداد 20 إلى 50٪ (ث / ت) السكروز التدرجات ملاحظة: مصنوعة من التدرجات من 4 طبقات من السكروز (50٪، 35٪ و 2 طبقات من 20٪) في 13.2 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة. في تجربتنا، وسكب السكروز 20٪ في طبقتين منفصلتين يحسن إلى حد كبير نوعية الاستعدادات polysome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم. التأكد من أن جميع الحلول ريبونوكلياز والدناز الحرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10X محلول الملح: 400 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.4، 200 ملي بوكل و 100 ملي MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 M السكروز الحل: للحصول على 200 مل، حل 137 غرام من السكروز في 1X محلول الملح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل السكروز في محلول الملح، كما هو موضح في الجدول رقم 1، لإعداد التدرجات. أحجام معينة لمدة ستة التدرجات. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تركيز السكروز النهائي </td><td> السكروز 2M (مل) </td><td> الملح حل 1X (مل) </td><td> المجلد النهائي. (مل) </td></tr><tr><td> 50٪ </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35٪ </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20٪ </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20٪ </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. التخفيفات من الحل السكروز لإعداد ستة التدرجات. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طبقات كما في الجدول 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> طبقة السكروز </td><td> 50٪ </td><td> 35٪ </td><td> 20٪ </td><td> 20٪ </td></tr><tr><td> المجلد. (مل) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. حجم محلول السكروز لكل طبقة. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد صب كل طبقة، والحفاظ على الأنابيب في -40 درجة مئوية أو الفريزر -80 درجة مئوية حتى التجميد الكامل قبل إضافة طبقة السكروز المقبلة. وحققت تجميد عادة بعد 2 ساعة عند -40 درجة مئوية، ولكن الانتظار حوالي 6 ساعات قبل صب الطبقة التالية ينصح. ومشاركة 20٪ طبقة يمكن تجميد أو إضافتها حديثا في يوم التجربة. ملاحظة: تجميد كل طبقة قبل إضافة واحدة المقبل يمنع من أي خلط أو اضطراب في طبقات. التدرجات يمكن الاحتفاظ بها في -40 درجة مئوية أو الفريزر -80 درجة مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن قد تم القيام به، إضافة مشاركة 20٪ طبقة إلى التدرجات في يوم التجربة. ثم، والسماح للالتدرجات ذوبان الجليد في غرفة باردة أو الثلاجة. </li></ol> 2. إعداد عصاري خلوي مقتطفات ملاحظة: نحن موصىينتهي باستخدام اثنين من التدرجات في عينة بيولوجية. 300 ملغ هو المبلغ الأمثل من المواد النباتية لإعداد اثنين من التدرجات عند العمل مع 6 أيام القديمة الشتلات نبات الأرابيدوبسيس thaliana. عند العمل مع أقل الأنسجة النشطة translationally، كمية من المواد النباتية يمكن زيادة تصل إلى 600 ملغ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد ستة أيام العمر الشتلات المزروعة في نصف Murashige وسكوغ 8 متوسطة تستكمل مع 1٪ سكروز أو وسائل الإعلام ما يعادلها من تجميد سريعة في النيتروجين السائل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المواد النباتية طحن في بمدافع الهاون precooled ومدقة مع النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 300 ملغ من مادة البودرة في صحن وزنها precooled. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب ذوبان العينة. ملاحظة: حافظ على العينات المجمدة لمدة لا تزيد على أسبوع في الثلاجة -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.4 مل من العازلة polysome precooled (محلول الملح 4X، 5.26 ملي EGTA، 0.5٪ (ت / ت) Octylphenoxy بولي (ethyleneoxy) الإيثانول، تشعبت، 50 ميكروغرام.ملليلتر -1 سيكلوهيكسيميد، 50 ميكروغرام.ملليلتر 1الكلورامفينيكول) والتجانس عن طريق خلط مع طرف ماصة. نقل إلى قسمين أنابيب 1.5 مل. العمل بسرعة لمنع عينات من ارتفاع درجات الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في microcentrifuge لتكوير الحطام. ملاحظة: لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، ودائما الحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية، واستخدام ريبونوكلياز / الدناز الحلول الحرة والعمل في ظروف خالية ريبونوكلياز / الدناز. الهيبارين يمكن أن تضاف إلى المخزن المؤقت polysome، إلى التركيز النهائي من 300 ميكروغرام.ملليلتر -1، لتعزيز حماية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، منذ الهيبارين يمكن أن تتداخل مع تحليل المصب، فإنه سيتعين إزالتها أثناء الخطوة هطول RNA عن طريق أداء هطول الأمطار كلوريد الليثيوم بدلا من هطول الأمطار الإيثانول (راجع المذكرة 4.7). </li></ol> 3. Polysome التنميط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بعناية طاف دون الإخلال بيليه. إذا تم pipetted شظايا مصنع، كرر الخطوة 2.5. تحميل طاف على رأس التدرج pipettin بلطفز على جدار الأنبوب في دفق مستمر. استخدام التدرج واحد لكل أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى precooled الدلاء وأجهزة الطرد المركزي في 175000 x ج لمدة 2 ساعة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية، في نابذة فائقة السرعة (على سبيل المثال 32،000 دورة في الدقيقة عند استخدام الدوار SW41). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نظام لجمع التدرج كما هو موضح في الشكل 1. كفيت الأشعة فوق البنفسجية لها طول المسار 1 مم. </li></ol><img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> الشكل 1. نظام جمع التدرج. يتم توصيل كفيت الأشعة فوق البنفسجية من أنابيب البولي فينيل كلورايد لأنبوب الزجاج الشعرية التي ينحدر إلى أسفل التدرج. التدرج تقدم من خلال ذلك بفضل نظام لمضخة تحوي. OD 260 قراءة بشكل مستمر ويتم جمع 2 مل الكسور. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من</a>هذا الرقم. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط جامع جزء لRT، وتعيين دائري بسرعة من شأنها أن تسمح جمع 2 مل الكسور. استخدام أنابيب تبريد قبل المجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكسور من أسفل إلى أعلى باستخدام أنبوب زجاجي الشعرية متصلة بواسطة أنابيب البولي فينيل كلوريد إلى نظام جمع الانحدار. استخدام فيلم البارافين البلاستيك لتأمين الاتصال بين أنابيب البولي فينيل كلورايد وأنبوب زجاجي الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الامتصاصية في 260 نانومتر من أسفل إلى أعلى التدرج. عندما يتم جمع التدرج بأكمله، ووضع أنابيب جمع على الجليد قبل استخراج الحمض النووي الريبي. </li></ol> 4. استخراج الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الكسور التي تم جمعها من اثنين من التدرجات، في 50 مل توج أنابيب الطرد المركزي، على النحو التالي: Polysomes: كسور 1-3 (12 مل) Monosomes: جزء 4 (4 مل) طاف: كسور 5 و 6 (8 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل جزء، إضافة 1 المجلد. 8M هيدروكلوريد جوانيداين،50 ميكروغرام الاكريليك الناقل و 1.5 المجلد. الأيسوبروبانول. ملاحظة: الاكريليك الناقل الأكريلاميد خطية، كما تستخدم لcoprecipitant لتحسين الانتعاش من الأحماض النووية أثناء هطول الأمطار الكحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من قبل قلب الأنابيب ويعجل O / N في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 175000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية، في نابذة (32،000 دورة في الدقيقة في الدوار SW32). إذا تم تنفيذ الخطوة هطول الأمطار في أنبوب وهو غير متوافق مع تنبيذ فائق، ونقل إلى أنبوب مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل وطاف حل بيليه في 200 ميكرولتر TE العازلة خالية من ريبونوكلياز (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7،5-1 ملم EDTA). نقل إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 المجلد. الفينول المياه المشبعة (درجة الحموضة 6.6) و 1 المجلد. الكلوروفورم: الكحول أيزو أميلي (24: 1). مزيج بقوة. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية لأنبوب 1.5 مل جديد. ملاحظة: الفينول حمض (4.5 درجة الحموضة) يمكن استخدامها من أجل تقليل التلوث الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 1/10 المجلد. 3 M خلات الصوديوم و 3 المجلد. الإيثانول بنسبة 100٪. السماح هطول الأمطار في -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو O / N في -20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. ملاحظة: في حالة استخدام الهيبارين في المخزن المؤقت polysome (راجع المذكرة 2.5)، إجراء كلوريد الليثيوم (LiCl) هطول الأمطار بدلا من الإيثانول لإزالة أي أثر للالهيبارين التي يمكن أن تتداخل مع تحليل المصب 9 بشكل صحيح. بعد الاستخراج، إضافة LiCl إلى تركيز النهائي من 2.5 م السماح هطول الأمطار لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو O / N عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 500 ميكرولتر 75٪ من الإيثانول. الهواء الجاف وبيليه وتذوب في المخزن TE 30 ميكرولتر. تقييم نوعية الحمض النووي الريبي الكهربائي على ريبونوكلياز مجانا 1.2٪ agarose هلام (100V، 15 دقيقة) أو عن طريق الأساليب الشعرية الكهربائي. </li></ol> تحليل 5. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيانات الخام للتصدير لبرامج الرسم وتحليل البيانات. ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2A وباء، لمحات الخام تعطي المعلومات النوعية: عدد من القمم polysome التي يمكن أن ينظر إليها، في ذروة الذروة صبغي جنسي أحادي، وجود الكتف المقابلة لمفارز الريبوسوم الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج التشكيلات للسماح للمقارنة بين الملفات الشخصية بين العينات. استخدام أداة قارئ الشاشة لتحديد قيمة X الذروة صبغي جنسي أحادي لكل عينة ومحاذاة القمم صبغي جنسي أحادي عن طريق إزالة نقاط بيانات إضافية في بداية المنحنيات. تحديد أدنى نقطة من منحنى وتحديد قيمة Y لها (باستخدام أداة قارئ الشاشة). تعيين أدنى قيمة Y أشر إلى 0 باستخدام وظيفة &quot;قيمة تعيين الأعمدة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نسبة polysomes / monosomes من خلال دمج المنطقة تحت المنحنى من ملامح الخام (الشكل 3C). استخدام أداة محدد البيانات لتحديد حدود المنطقة لتكون متكاملة. ثم استخدم وظيفة دمج (التحليل الرياضيات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيعمنحنيات إلى الذروة صبغي جنسي أحادي بقسمة جميع نقاط البيانات منحنى من قيمة Y من قمة الذروة صبغي جنسي أحادي (تحديد باستخدام أداة قارئ الشاشة). حدد العمود، ثم تحت التحليل الرياضيات، حدد تطبيع واختيار &quot;مقسوما على قيمة محددة&quot; الأساليب. هذه الخطوة تتيح المقارنة بين المستوى النسبي للpolysomes (الشكل 3D). </li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> الشكل 2. ملامح polysome التمثيلية. نبات الأرابيدوبسيس thaliana البرية من نوع (بالوزن، نوع إيكولوجي العقيد-0) كانت تزرع الشتلات ومتحولة لمدة ستة أيام على ½ وسط موراشج وسكوج تحت الضوئية يوم طويل (ضوء 16 ساعة، 8 ساعات الظلام). ج: لمحات polysome الخام من الشتلات بالوزن. ب: لمحات polysome الخام من الشتلات متحولة. C: تحديد نسبة polysomes وmonosomes من التكامل في المنطقة تحت المنحنى D: بروفي Polysomeليه تطبيع إلى الذروة صبغي جنسي أحادي. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<ol>
	<li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+in+plant+biology.">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017 (2015).</li><li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast.">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li><li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms:+30+Years+Later.">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li><li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starting+the+protein+synthesis+machine:+eukaryotic+translation+initiation.">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li><li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics.">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li><li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression.">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis protocols. , (2006).</li><li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+and+transcript+copy+numbers,+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis.">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).</li><li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Profiling+Analysis.">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li><li>Y&#225;ng&#252;ez, E., Castro-Sanz, A. B., Fern&#225;ndez-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li><li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels.">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li><li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs.">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li><li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness.">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting.">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470 (10), (2010).</li><li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis.">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ribosomes to the mRNA (as cycloheximide does for the cytosolic ribosomes)12 . We have also reduced the total ultracentrifugation time7.
To obtain high quality polysome profiles, it is essential to use freshly collected plant material and to perform all steps at 4&#176;C. When using tissues that are poorly translationally active, more plant material can be loaded on the gradient (up to 600 mg).
Analysis of polysome profiles can provide insights into both the overall translational status of cells13 and the translational status of a specific mRNA. We have used RNAs isolated by this method for different applications. Using the RNAs for microarrays allowed us to identify a class of cadmium stress response genes for which transcription and translation are uncoupled 14. We also used this method to identify small RNAs associated with polysomal fractions. This identification was made by northern blotting15 of RNA extracted from polysomal fractions, and provided biochemical evidence for a translational component in the miRNA pathway in plants. In another study, a cis-NAT RNA was identified by quantitative RT-PCR. This cis-NAT is associated to the phosphate homeostasis and promote translation of the PHO1;2 transcript 16. 
The main limits of the polysome profiling approach are the lack of information concerning both the position of the ribosome on the mRNA and its progression along the mRNA. Ribosome profiling has emerged to address these limitations 17 and has been successfully used on plant tissues18. Ribosome profiling provides a global measurement of translation by taking advantage of the advances in sequencing technology. Nevertheless, as for any sequencing based assays, the quality of the results depends on the mapping of the sequences to the genome, therefore focusing on the small ribosome-protected fragments makes it difficult to deconvolute repetitive sequences. Moreover, the digestion of RNA not protected by the ribosomes leads to the loss of regulatory information contained in the 3' and 5' UTRs. It is then impossible to distinguish transcript variants that have different 3' or 5' UTRs and show different levels of translation19. The polysome profiling method described here is rapid and does not require specific technical skills. Altogether, these two methods represent complementary approaches to study translation regulation.

تخليق البروتين هو عملية أساسية ومكلفة بقوة في جميع الخلايا 1. أولا وقبل كل شيء، يجب أن الخلايا استثمار الطاقة في إنتاج الآلات الترجمة، والريبوسومات. على سبيل المثال خلية الخميرة تقسيم بنشاط تنتج ما يصل الى 2000 الريبوسومات في الدقيقة الواحدة. ويتطلب هذا الإنتاج إلى 60٪ من إجمالي النشاط النسخي، وتصل إلى 90٪ من النشاط الربط الكلي للخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطاقة اللازمة لتركيب الأحماض الأمينية، أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال والسندات الببتيد. في النباتات، إضافة حمض أميني واحد إلى تكاليف سلسلة ببتيد 4،5-5،9 جزيئات ATP 3. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة من مرنا إلى البروتين هو موقع كبير من التنظيم، لا سيما عندما يتعلق الأمر بالتعامل مع الظروف البيئية المتغيرة. الخطوة الشروع في الترجمة، وهذا هو جمعية مرنا مع الريبوسوم، هو الهدف الرئيسي من تنظيمترجمة 4. ونتيجة لذلك من اللائحة الترجمة فضلا عن غيرها من الخطوات التنظيمية بعد النسخي، 40٪ فقط من التغيرات في تركيز البروتين يمكن تفسير مرنا وفرة 5،6. وهكذا، فإن الدراسة من إجمالي مرنا تعطي معلومات فقيرة نسبيا عن وفرة البروتين. من ناحية أخرى، فإن جمعية مرنا مع الريبوسومات يعطي نظرة أفضل إلى وفرة البروتين مما يتيح الوصول إلى تلك من mRNAs المشاركة في الترجمة. وترتبط من mRNAs تترجم بنشاط مع العديد من الريبوسومات في هياكل ودعا polysomes. على العكس من ذلك، سوف تكون مرتبطة من mRNAs سوء ترجمة مع الريبوسوم واحدة فقط (صبغي جنسي أحادي). ونتيجة لذلك، ووضع متعدية من مرنا يمكن تقييمها من خلال رصد ارتباطه الريبوسومات 7. يصف هذا البروتوكول عزلة polysomes من ستة أيام القديمة الشتلات نبات الأرابيدوبسيس thaliana، والعزلة لاحقة من الحمض النووي الريبي، وتحليل النتائج. بويتم فصل lysomes وmonosomes من خلال التدرج الكثافة السكروز. يتم جمع التدرجات إلى ستة أجزاء. يتم تجميع بعض الكسور للحصول على ثلاثة أجزاء يفصل جيدا: polysomes، monosomes والأجزاء الخفيفة (ويشار إليها طاف)، الذي يحتوي على حرة 60S و 40S مفارز الريباسي ومن mRNAs التي لا ترتبط مع الريبوسومات. ويمكن تقدير حركة الترجمة العالمي من خلال توليد polysome / نسبة صبغي جنسي أحادي، والتي يتم تحديدها من قبل الاندماج في المنطقة تحت المنحنى، وبمقارنة ملامح polysomes. ثم يتم استخراج من mRNAs والبروتينات من كسور مختلفة وتستخدم للتحليل RT-PCR، QRT-PCR، لطخة الشمالية، ميكروأري، لطخة غربية أو البروتينات. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول للنباتات والأنسجة الأخرى. تم العثور على المعدات اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول عادة في معظم المختبرات: ليست هناك حاجة لصانع التدرج. تجميد كل طبقة قبل إضافة واحدة المقبل منعالصورة من أي مزيج أو اضطراب في طبقات. لا يتم استخدام ثاقبة أنبوب لجمع الانحدار الذي لا يمكن أن يتحقق عن طريق الغمر من أنبوب زجاجي الشعرية في الانحدار. لذلك، لا تزال أنابيب نابذة مكلفة التالفة ويمكن إعادة استخدامها مرات عديدة. بشكل جماعي، وهذا يجعل هذا البروتوكول وسيلة سهلة ورخيصة لتحديد ملامح polysome.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary tube</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima series</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV cuvette</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Quartz flow-through cuvette</td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Read every 0.0125 sec</td></tr><tr><td>All chemicals</td><td>Any</td><td></td><td>Use only Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free water</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide (acryl carrier)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA precipitation carrier</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analysis software</td></tr></tbody></table>

an easy method for plant polysome profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

في الأدب، وغالبا ما تظهر ملامح polysome من الكسر الضوء على جزء الثقيل نتيجة الطريقة التي يتم جمعها التدرجات، أي من أعلى إلى أسفل. منذ ذلك الحين في بروتوكول صفها هنا يتم جمع التدرجات من الأسفل إلى الأعلى، لمحات نظهر تبدأ جزء الثقيل (وpolysomes) والذهاب إلى الأجزاء الخفيفة (مفارز الريبوسوم مجاني والرنا) (الشكل 2A). ثم نقوم بجمع كل التدرج في ستة 2 مل الكسور، ولكن أجزاء أصغر يمكن جمع ما إذا كان تحليل أكثر تفصيلا لمحتوى polysome لابد من القيام بها. دمج وتطبيع منحنيات إلى الذروة صبغي جنسي أحادي (الشكل 2D) يسمح للمقارنة لمحات من خطوط مختلفة أو ظروف النمو. وهذا يوفر معلومات عن مقدار النسبي للpolysomes بشكل مستقل عن مستوى البدء. وهناك طريقة أخرى لnalyze لمحات هو لحساب المساحة تحت منحنى، وبالتالي، يمكن للمرء أن تحديد كمية النسبية للمرنا المرتبطة إما monosomes أو polysomes (الشكل 2C). هذه النسبة هي محددة لظروف النبات والنمو. ومع ذلك، قد لا يكون هذا النهج ذات الصلة في حالة الأنسجة النشطة translationally سيئة. وقد استخدمنا هذه الطريقة لأ. الشتلات كاملة thaliana والوريدات الصغار والكبار، فضلا عن N. benthamiana (الشكل 3C)، S. قوطة (الشكل 3E) و O. أوراق البركة (الشكل 3D). شكل الملف الشخصي يعتمد على ظروف النمو، عمر النبات والأنسجة تحليلها. نحن هنا تستخدم A. thaliana ستة أيام الشتلات القديمة. في هذه المرحلة، والنشاط متعدية عالية، والتعريف يظهر بشكل جيد قمم شكل (الشكل 2A وباء). هذا هو الحال أيضاعندما A. وتستخدم thaliana الزهور (الشكل 3A). عند استخدام A. 4 أسابيع من العمر thaliana ريدات (الشكل 3B)، وعينات تحتوي في الغالب يترك الكبار كاملة النمو حيث خلايا لا تنقسم. وبالتالي، فإن المبلغ الإجمالي للpolysomes وmonosomes أقل. ويكشف بيان أقل، ولكن لا يزال جيدا على شكل قمم polysome. بجانب ذروة صبغي جنسي أحادي، ويظهر الكتف كمية كبيرة من 60S حرة مفارز الريباسي. مع نوع آخر من النباتات أو الأنسجة، قد تكون القمم polysome بالكاد مرئية. هذا هو الحال عند استخدام 30 يوما O. القديم أوراق البركة (الشكل 3D). حتى عندما كمية من mRNAs تشارك في الترجمة منخفض جدا (لا يمكن رؤية قمة polysome على الملف الشخصي)، وجود ذروة صبغي جنسي أحادي يشير إلى أن تجزئة تم القيام به بشكل صحيح، وأنه من mRNAs يمكن زيادة المستخرج من جزء لمزيد من التحليل . ويتم تقييم جودة نوعية الحمض النووي الريبي المستخرج من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز ( <str<html> أونج&gt; الشكل 4). يجب أن يكون 25S و 18S عصاري خلوي الحمض النووي الريبي الريباسي واضحة للعيان على هلام. يجب أن العصابات أقل الموافق الحمض النووي الريبي الريباسي chloroplastic أيضا أن تكون واضحة عندما يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة الخضراء 10. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig3.jpg" /> الشكل 3. ملامح Polysome من المواد النباتية المختلفة والأنواع. (A) الزهور نبات الأرابيدوبسيس thaliana (على 300mg)، (ب) نبات الأرابيدوبسيس thaliana 4 أسابيع ريدات القديمة (600mg)، (C) النيكوتين benthamiana (يترك الشباب من 40 أيام قصيرة النباتات التي تزرع في يوم والقديمة - على 300mg)، (D) أرز أسيوي ( يترك لمدة 30 يوما النباتات القديمة - على 300mg)، (E) مغد قوطة (يترك الشباب من 35 أيام قصيرة النباتات التي تزرع في يوم والقديمة - على 300mg). يشار إلى قمم صبغي جنسي أحادي من السهام.ديزيل / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig4.jpg" /> . الشكل 4. تقييم نوعية الحمض النووي الريبي RNA (500 نانوغرام المستخرجة من يطلق النار من 6 أيام القديمة الشتلات نبات الأرابيدوبسيس thaliana) من الكسور وأشارت تم تحميلها على هلام الاغاروز 1.2٪ ومفصولة الكهربائي (100V - 15 دقيقة). يشار إلى عصاري خلوي (25S و 18S) الريباسي من رؤوس سهام وchloroplastic (23S و 16S) الريباسي من قبل شريحة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54231/54231fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Easy Method for Plant Polysome Profiling at JoVE.com

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  Aix-Marseille Université. This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Video: An Easy Method for Plant Polysome Profiling

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper describes methods optimized to isolate plant-derived polyribosomes and their associated mRNAs to be analyzed using RNA-sequencing. First, cytoplasmic lysates are obtained through homogenization in polysome- and RNA-preserving conditions from whole, frozen soybean nodules. Then, lysates are cleared by low-speed centrifugation, and 15% of the supernatant is used for total RNA (TOTAL) isolation. The remaining cleared lysate is used to isolate polysomes by ultracentrifugation through a two-layer sucrose cushion (12% and 33.5%). Polysome-associated mRNA (PAR) is purified from polysomal pellets after resuspension. Both TOTAL and PAR are evaluated by highly sensitive capillary electrophoresis to meet the quality standards of sequencing libraries for RNA-seq. As an example of a downstream application, after sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to obtain differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels. In summary, this method, in combination with RNA-seq, allows the study of the translational regulation of eukaryotic mRNAs in a complex tissue such as the symbiotic nodule.

This protocol describes a method for eukaryotic polysome purification from intact soybean nodules. After sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to identify differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels.

تنقية بوليسوم من العقيدات التكافلية لفول الصويا

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Developmental Biology

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

تحليل الترجمة في الدماغ الماوس النامية باستخدام التنميط متعددة

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Neuroscience

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...