Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo que revela detalhes moleculares sobre a atividade dos ribossomos dentro da célula. Essa técnica permite que os usuários obtenham as informações valiosas fornecidas por um perfil de polissomos, que não têm acesso a sistemas automatizados de fracionamento de gradiente. Tome seu tempo ao preparar os gradientes e armazene os gradientes em um local onde eles não serão interrompidos por um compressor ou outras operações mecânicas à medida que se estabelecem em um gradiente linear.
Para começar, preparar soluções-estoque de 7 e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose. Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 mícron. Preparar 14 mililitros de soluções de 17, 27% e 37% de sacarose, dispensando e misturando as soluções de estoque de 7 e 47%.
Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno em um rack de tubo de ensaio de visão completa. Certifique-se de que há espaço suficiente entre os tubos para que as ações com um tubo não perturbem os outros. Anexe uma agulha de nove polegadas, calibre 22 com uma ponta romba a uma seringa de três mililitros e execute um enchimento e dispense de teste para garantir que a seringa possa segurar a solução de sacarose sem qualquer gotejamento antes de configurar os gradientes.
Adicione dois mililitros de sacarose a 7% ao fundo de cada tubo de centrífuga. Em seguida, adicione dois mililitros de sacarose a 17% abaixo da solução a 7%, posicionando a ponta da agulha nas imediações do fundo do tubo. Dispense a solução com cuidado e lentamente.
Repita o procedimento com dois mililitros cada uma das soluções de 27, 37 e 47% de sacarose, garantindo que cada camada seja distinguível da outra por uma linha que marque a separação das densidades. Armazene os gradientes a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que eles se instalem em uma porcentagem contínua e crescente de sacarose. Após o crescimento e colheita de leveduras, as células de Saccharomyces cerevisiae, ressuspendem as células em 700 microlitros refrigerados de tampão de extração de polissomos.
Adicione 100 unidades de inibidor de RNAse. Em seguida, adicione 400 microlitros de contas de vidro pré-refrigeradas com um tamanho aproximado de 425 a 600 mícrons. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com as contas de vidro e interrompa as células de levedura por agitação vigorosa em um batedor de contas por cinco minutos.
Depois de interromper as células, esclareça o lisado por centrifugação. Determine a concentração do RNA no lisado clarificado medindo a absorbância a 260 nanômetros, usando um sistema de detecção de RNA baseado em fluorescência. Certifique-se de que a concentração de RNA é de 0,5 a um micrograma por microlitro.
Se a concentração de RNA for muito baixa, reduza o volume de tampão de extração usado para ressuspender as células. Carregue cuidadosamente o lisado na parte superior dos gradientes. Coloque a ponta da pipeta contra a parede interna na parte superior do tubo de polipropileno.
Incline o tubo e dispense lentamente o lisado no topo do gradiente, pingando contra a parede. Coloque suavemente os tubos nos baldes pré-resfriados de um rotor de balde oscilante e centrifugar os gradientes. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da caçamba oscilante e coloque-os em um suporte de tubo.
Rotule as placas de 96 poços para armazenar as frações e pré-resfrie no gelo. Colete frações de 100 ou 200 microlitros a partir do topo do gradiente, inserindo cuidadosamente uma ponta de pipeta na parte superior do gradiente e coletando as frações até que todo o gradiente seja alíquotado. Medir a absorvância de cada fração a 254 nanômetros com um espectrofotômetro contra as soluções de 7 e 47% de sacarose em branco.
Crie o perfil de polissomo plotando o número de frações versus a absorvência. Três perfis de polissomas representativos da levedura S.Cerevisiae, são mostrados. A crista de cada subunidade ribossomal e pico de polissomo é aparente em cada perfil.
Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado aqui. Este perfil foi produzido a partir de um perfil de absorbância contínua à medida que o gradiente de sacarose era deslocado de baixo para cima por uma solução de perseguição, através de uma célula de fluxo detectora e coletado em frações. O perfil de polissomo gerado pelo fracionamento manual de amostras de 200 e 100 microlitros é mostrado aqui.
A coisa mais importante a lembrar com este procedimento é não interromper os gradientes. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar ou interromper o gradiente dispensando a solução muito rapidamente. Após este procedimento, o RNA pode ser extraído dos gradientes para análise adicional para determinar mRNAs que estão se associando a ribossomos ativos
