الخميرة هي كائن حي نموذجي شائع ، ليس فقط للدراسات الجينية ولكن أيضًا للدراسات الكيميائية الحيوية للبروتينات والجزيئات الضامة الأخرى المستخرجة من النوع البري وسلالات الخميرة المتحولة. ومع ذلك ، بسبب جدران الخلايا الصعبة ، فإن التحدي الرئيسي الذي يواجهه الباحثون هو هذا التحلل الفعال لخلايا الخميرة دون الإضرار بالمحتوى الخلوي. عادة ما تكون عزلة الجزيئات الحيوية الحيوية السليمة أمرًا حاسمًا ، وتعتمد على درجة الحرارة.
إعداد المستخلصات في درجة حرارة منخفضة يضمن أن البروتياز داخل الخلايا والنيات تبقى غير نشطة، مما يؤدي إلى عزل موثوق بها من البروتين سليمة، والأحماض النووية، والجزيئات الأخرى لتحلل كافية. طرق مختلفة متاحة للحصول على مقتطفات الخميرة من خلال الانزيمية، الكيميائية والفيزيائية. ومع ذلك تحلل الأنزيمية مكلفة بسبب شرط من الانزيمات النقية لهضم جدار الخلية، وبالتالي الحد من استخدام عدد أقل من الخلايا.
مزيد من ردود الفعل الأنزيمية يجب أن تكون رصدت عن كثب لمنع أكثر من الهضم وتحلل سابق لأوانه من الخلايا. الأساليب الكيميائية باستخدام عوامل denaturing قوية، على الرغم من فعالية، يؤدي إلى denaturation البروتينات وعلى هذا النحو، ليست مناسبة لعزل مجمعات البروتين أو الإنزيمات الوظيفية. يمكن تنفيذ الطرق الفيزيائية ، مثل التحلل تحت ضغط عال في الصحافة الفرنسية في البرد عند أربعة مئويات ولكن هذا ليس باردًا بما يكفي لمنع تدهور جميع البروتينات المحلية وتآكلها.
الأساليب المادية الشعبية الأخرى هي استخدام هاون وحشرات، خلاط، أو طاحونة القهوة لطحن خلايا الخميرة resuspended في عازلة تحلل والمجمدة كما قطرات أو طحن وخليط من الخرز الزجاجي والخميرة في طاحونة سريع خرزة الإعدادية أو تحلل بواسطة sonication. ومع ذلك، طحن يدوي هو العمل المكثف وغلة البروتين الناتجة يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على التقنيات المستخدمة في حين تحلل عن طريق sonication أو طحن في خلاط، طاحونة القهوة، أو مطحنة الخرز يولد كمية كبيرة من الحرارة، مما يؤدي إلى التآكل البروتين وتدهور. لذلك ، للحصول على تحلل خلايا الخميرة مع البروتينات في حالتها الأصلية مع الحد الأدنى من التآكل والتحلل لتطبيقات مثل تنقية مجمعات البروتين الوظيفية ، والمقايسات الكيميائية الحيوية أو الكشف عن التعديلات العابرة بعد الترجمة ، فمن الضروري استخدام طريقة تحلل قابلة للتطوير بسهولة من شأنها تقليل توليد الحرارة مع السماح للتحلل الفعال بغض النظر عن كمية الخلايا.
هنا نصف الطريقة التي تنطوي على استخدام مطحنة التجميد المبرد لتحلل الخلايا في النيتروجين السائل في ناقص 196 درجة مئوية لتوليد مقتطفات الخلايا المجمدة مما يسمح لاستعادة الجزيئات الوظيفية سليمة، مثل البروتينات أو الحمض النووي والحمض النووي، في درجات حرارة منخفضة جدا مما يقلل من التآكل والتدهور. ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للاستخدام مع أي نوع من عينات الخلايا أو الأنسجة من أي نوع، بما في ذلك الطب الشرعي وحتى العينات القديمة التي تم استردادها من المواقع الأثرية أو وجدت مجمدة في الجليد الدائم. تستخدم مطحنة الفريزر غرفة طحن كهرومغناطيسية فائقة التوصيل تتحرك بسرعة شريط معدني صلب ذهابا وإيابا داخل ملف بولي كربونات يحتوي على العينة ليتم سحقها بين المقابس نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ.
هذا الأسلوب تحلل الخلايا المادية يسمح لتحلل أكثر كفاءة والنتائج reproducibly في استخراج نوعية أفضل. تزرع خلايا الخميرة بتركيز 10 مليون خلية لكل مل. تم وضع هذه الخلايا الخميرة قبل زجاجة الطرد المركزي المبردة ونسج لمدة 10 دقائق في 2، 400 G.مرة كاملة تدور، decant ناكر دون إزعاج الخلايا بيليه.
تم إعادة تعليق هذه الكريه في كمية صغيرة من الماء البارد المثلج ، حوالي نصف الحجم الأولي للثقافة لغسل الخلايا. تم نسج الخلايا resuspended مرة أخرى أسفل لمدة 10 دقائق أخرى في 2، 400 G.Once تدور المقبل هو كامل، ونحن، مرة أخرى، decant كل نابيرينت دون إزعاج بيليه. ثم سيتم إعادة تعليق هذه الكريه و 15 مل من الجليد الباردة العازلة التحلل.
تأكد من أن بيليه هو resuspended تماما. يجب أن تبقى الخلايا التي تم تعليقها على الجليد في أنبوب ملحوظ مسبقًا حتى تصبح جاهزة للخطوة التالية. ارتدي دائماً معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع النيتروجين السائل، مثل نظارات السلامة، وحماية اليدين، ومعاطف المختبر.
لتحقيق أقصى قدر من البراعة لدينا، ونحن في كثير من الأحيان ارتداء زوج من القفازات الحرارية البيضاء تقع بين اثنين من أزواج من قفازات نيتريل. تغيير قفازات الخارجي والنيتريل في كثير من الأحيان، لأنها مزق بسهولة بعد التعرض للنيتروجين السائل. في مختبرنا، ننقل اِكاء من النيتروجين السائل إلى حاوية صغيرة من النيتروجين السائل سعة خمسة لترات.
ثم يسكب النيتروجين السائل في أنبوب 50 ML الذي تم تبريده مسبقًا على الجليد الجاف. مرة واحدة في أنبوب 50 ML مليء بالنيتروجين السائل، ونحن إضافة استخراج الخميرة ببطء، بطريقة حكيمة قطرة إلى أنبوب في زيادات 1.5 ملليلتر. لتقليل تكوين الكريات الفشار الكبيرة ، يضاف تعليق الخميرة في حركة دائرية.
لمزيد من منع تشكيل الكريات الفشار كبيرة، ونحن نستخدم ملقط كبيرة لضمان جميع الكريات بين 0.3 و 0.5 سم في القطر. لأن النيتروجين السائل يتبخر دائما، تأكد من إعادة ملء الأنبوب مع النيتروجين السائل قبل إضافة كل aliquot 1.5 مل من تعليق الخميرة. مرة واحدة وقد بذلت كل من تعليق الخميرة في الفشار تسمح للأنبوب مع الفشار للجلوس دون غطاء لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح لجميع النيتروجين السائل المتبقية لتتبخر.
للتأكد من أن جميع النيتروجين السائل قد تبخرت، أغلق الغطاء تماما تقريبا ويهز بلطف. إذا كان هناك ضوضاء هيسينغ ، فإنه يشير إلى أن النيتروجين السائل لم يتبخر بالكامل بعد. افتح الغطاء لمدة دقيقة أخرى أو نحو ذلك للسماح للنيتروجين السائل المتبقي بالتبخر قبل إغلاق الغطاء بإحكام.
قد يسبب السائل المتبقي في الأنبوب انفجارًا إذا تم إغلاق الغطاء قبل الأوان. يمكن تخزين هذا الفشار الخميرة إلى أجل غير مسمى تقريبا في ناقص 80 درجة C.for ما لا يقل عن خمس عينات, ضمان أن لديك 30 إلى 35 لترا من النيتروجين السائل المتاحة. املأ مطحنة التجميد إلى الخط الكامل واغلق الغطاء للسماح لمطحنة الفريزر بالبرد لبضع دقائق.
مرة أخرى، تذكر دائما لارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع النيتروجين السائل. يجب أن تكون قوارير طحن البولي، المقابس نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ، وشريط المؤثرات مبردة مسبقا مع النيتروجين السائل. الحفاظ على هذه المكونات المغمورة حتى يتوقف النيتروجين السائل محتدما.
تذكر أن تبقي جميع عينات الفشار على الجليد الجاف حتى اكتمال عملية الطحن بأكملها. سحب كل النيتروجين السائل من طحن قوارير ونقل الفشار الخاص بك في القارورة. لا تنسى أن تضع شريط المؤثرات المغناطيسية في طحن قارورة كذلك.
ختم قارورة طحن عن طريق وضع بعناية المكونات الفولاذ المقاوم للصدأ بالتساوي على نهاية طحن قارورة. نحن الانفجار كل نهاية من قوارير طحن على لوح خبز خشبي مع اهتزاز امتصاص المطاط دعم لضمان أن يتم وضع المقابس نهاية بشكل صحيح ويتم ختم قوارير طحن بإحكام. من المهم تأمين سدادات النهاية لضمان أنها لن تأتي فضفاضة والسماح للعينات لتسرب في مطحنة الفريزر أثناء عملية الطحن.
ضع قارورة طحن في غرفة طحن مطحنة الفريزر وقفل في مكانها. أغلق غطاء مطحنة الفريزر وطحن العينة لمدة ثلاث دورات في دقيقتين لكل دورة، بمعدل ساحق قدره 14. بعد دورات طحن كاملة فتح القارورة مع مسحوق خلية المجمدة lysate.
لمنع lysate من ذوبان، والعمل بسرعة وبعناية لفك واحدة من المقابس نهاية باستخدام أداة فتح. بمجرد فتح القارورة، قم بإزالة شريط الارتطام ونقل مستخلص المسحوق المجمد بسرعة على طبق وزنها البلاستيكي المبرد مسبقًا. استرداد أكبر قدر من استخراج المجمدة قدر الإمكان عن طريق ضجيجا القارورة على لوح الخبز الخشبي.
بمجرد إزالة كل مسحوق من القارورة، بسرعة نقل جميع مستخلصات مسحوق إلى ما قبل المسمى 15 مليون أنبوب الاحتفاظ بها على الجليد الجاف. على الرغم من أنه من الأفضل المضي قدما في ذوبان الذوبان واستخدام مقتطفات على الفور للحد من تدهور البروتين، يمكن تخزين مسحوق المجمدة بين عشية وضحاها في ناقص 80، إذا لزم الأمر. ذوبان خارج مسحوق lysate ببطء في الطين الجليد الذي يتم تداوله باستمرار باستخدام شريط ضجة المغناطيسي في دلو الثلج.
لتسهيل حتى ذوبان الجليد، وإزالة الجليد الذي يتطور على السطح الخارجي للأنابيب في كثير من الأحيان، كل خمس دقائق تقريبا أو نحو ذلك. مرة واحدة في استخراج تبدأ في ذوبان في 1X protease المانع كوكتيل و 10 مثبطات البروتين ميكرومولر MG132 لمنع تدهور البروتين. مرة واحدة يتم إذابة العينات تماما، والتي يمكن أن تستغرق أكثر من ساعة، تدور أسفل العينات في 3، 220 G لمدة 20 دقيقة في درجة أربع درجات مئوية.
هذا الدوران سوف يزيل معظم حطام الخلية من lysate. عندما تدور كاملة نقل عظمى في زجاجات البولي التي تم تبريدها مسبقا على الجليد والتخلص من بيليه. أجهزة الطرد المركزي الفائقة والعينات في 16، 000 G في درجة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتوضيح استخراج.
بعد اكتمال الدوران، يسترجع فقط فائقة واضحة بعناية من منتصف العمود السائل دون إزعاج طبقة غائمة تحتوي على قطعة على رأس أو الحطام بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. نقل lysate واضحة في أنبوب 15 مل المبردة الطازجة. يمكن مؤخرا طرد السائل الملبدة بالغيوم المتبقية لمدة خمس دقائق بنفس السرعة للسماح لاسترداد بعض أكثر من lysate الجملة.
والمقتطفات جاهزة الآن للاستخدام في التجارب، مثل تنقية مجمعات البروتين والمناعة. قارنا طريقتين مختلفتين من تحلل خلايا الخميرة ، وهما طحن حبة الزجاج في أربع درجات مئوية وطريقة طحن التبريد الآلي في ناقص 196 درجة مئوية لتقييم البروتينات المسترجعة النسبية ومستخلصات الخلايا المعدة بكلتا الطريقتين. من هذه الدراسة اخترنا استخدام سلالة الخميرة في مهدها تحمل بلازميد نسخة عالية التعبير عن ubiquitin مضاف HIS-MYC.
حتى نتمكن من تقييم تقارب الانتعاش من البروتينات متعددةubiquitinated الموسومة من مقتطفات بالجملة، بعد تنقية تقارب باستخدام TALON الكوبالت حبات تقارب العلامة HE تليها النشاف الغربية مع جسم مضاد العلامة وحيد النسيلة HIS. البروتينات متعددةubiquitinated التي عادة ما تكون قصيرة جداً عمر بسبب تدهورها السريع من قبل الآلات البروتيما في كل مكان، وبالتالي تقدم طريقة جيدة جداً لمقارنة نوعية مقتطفات الجملة التي أعدتها أساليب مختلفة. كما نرى من قبل النصف الأيمن من بونساو غشاء الملون، استعدنا أعلى غلة البروتين الكلي في مقتطفات بالجملة التي أعدتها بروتوكول مطحنة التجميد كما حكم عليها بونساو أكثر كثافة تلطيخ في جميع أنحاء حارة استخراج الجملة.
هذا واضح بشكل خاص في الأجزاء السفلى والعليا من مطحنة التجميد تستخرج الممرات. بالإضافة إلى ذلك، كما هو مبين من قبل النصف الأيمن من العلامة هي بقعة الغربية، لاحظنا انتعاش أفضل من HIS-MYC العلامة في كل مكان البروتين في كل مكان تليها سحب أسفل باستخدام حبات تالون من مقتطفات بالجملة التي أعدتها طحن المبردة. نستنتج أن مطحنة التجميد المبردة متفوقة على الطرق الأخرى لإعداد مستخلصات الخلايا ، خاصة عندما تكون الجزيئات الجزيئات الوظيفية مطلوبة لتطبيق المصب.
