A levedura é um organismo modelo popular, não apenas para estudos genéticos, mas também para estudos bioquímicos de proteínas e outras macromoléculas extraídas do tipo selvagem e cepas de leveduras mutantes. No entanto, devido às suas paredes celulares resistentes, um grande desafio que os pesquisadores enfrentam é essa lise eficiente das células de levedura sem danificar o conteúdo celular. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente crítico, dependente da temperatura.
A preparação dos extratos em baixa temperatura garante que as proteases e núcleos intracelulares permaneçam inativos, resultando em isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para lise suficiente. Vários métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos de levedura através de enzimática, química e lise física. No entanto, a lise enzimática é cara devido à exigência de enzimas purificadas para digerir a parede celular, limitando assim o uso de menor número de células.
Além disso, as reações enzimáticas devem ser monitoradas de perto para evitar a digestão excessiva e a lise prematura das células. Métodos químicos utilizando agentes de desnaturação fortes, embora eficazes, resultam na desnaturação de proteínas e, como tal, não são adequados para o isolamento de complexos proteicos ou enzimas funcionais. Métodos físicos, como a lise sob alta pressão em uma imprensa francesa, podem ser realizados no frio a quatro Celsius, mas que não é frio o suficiente para evitar a degradação e a desnaturação de todas as proteínas nativas.
Outros métodos físicos populares são o uso de uma argamassa e pilão, liquidificador ou moedor de café para moer células de levedura resuspended em um tampão de lise e congelado como gotículas ou moagem e mistura de contas de vidro e levedura em um moinho de batedor de contas de preparação rápida ou uma lise por sônica. No entanto, a moagem manual é intensiva em mão-de-obra e o rendimento da proteína resultante pode variar consideravelmente dependendo das técnicas empregadas enquanto a lise por sônica ou moagem em um liquidificador, moedor de café ou moinho de batedor de contas gera uma quantidade substancial de calor, o que resulta em uma desnaturação e degradação proteica. Portanto, para obter lise celular de levedura com proteínas em seu estado natal com desnaturação mínima e degradação para aplicações como purificações de complexos proteicos funcionais, ensaios bioquímicos ou detecção de modificações pós-translacionais fugazes, é essencial usar um método de lise facilmente escalável que minimizará a geração de calor, permitindo uma lise eficiente, independentemente da quantidade de células.
Aqui descrevemos um método que envolve o uso de uma fábrica de congeladores criologicamente para a lise das células em nitrogênio líquido a menos 196 Celsius para gerar extratos de células congeladas, permitindo assim a recuperação de macromoléculas funcionais intactas, como proteínas ou DNA e RNA, a uma temperatura muito baixa que minimiza a desnaturação e a degradação. Este método pode ser prontamente adaptado para uso com qualquer tipo de amostra de célula ou tecido de qualquer espécie, incluindo amostras forenses e até antigas recuperadas de sítios arqueológicos ou encontradas congeladas em permafrost. A fábrica de congeladores usa uma câmara de moagem eletromagnética supercondutora que move rapidamente uma barra de metal sólido para frente e para trás dentro de um arquivo de policarbonato contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável.
Este método de lise celular física permite uma lise mais eficiente e, reproduvelmente, resulta em um extrato de melhor qualidade. As células de levedura foram cultivadas a uma concentração de 10 milhões de células por mil. Estas células de levedura foram colocadas antes da garrafa de centrífuga gelada e foram giradas por 10 minutos a 2.400 G.Uma vez que o giro está completo, decantar o sobrenante sem perturbar as células pelleted.
Esta pelota foi resuspended em uma pequena quantidade de água gelada, cerca de metade do volume inicial da cultura para lavar as células. As células resuspended foram novamente giradas para baixo por mais 10 minutos a 2.400 G.Uma vez que o próximo giro está completo, nós, novamente, decantamos todo o supernante sem perturbar a pelota. Esta pelota será então resuspended e 15 ML de tampão de lise gelada.
Certifique-se de que a pelota está completamente resuspendida. As células resuspended devem permanecer no gelo em um tubo pré-marcado até estar pronto para o próximo passo. Use sempre equipamentos de proteção individual ao manusear nitrogênio líquido, como óculos de segurança, proteção manual e jalecos.
Para maximizar nossa destreza, muitas vezes usamos um par de luvas térmicas brancas entre dois pares de luvas de nitrito. Troque as luvas externas e nitríis com frequência, pois elas rasgam facilmente após serem expostas a nitrogênio líquido. Em nosso laboratório, transferimos uma alíquota de nitrogênio líquido para um pequeno recipiente de nitrogênio líquido de cinco litros.
O nitrogênio líquido é então derramado em um tubo de 50 ML que foi pré-refrigerado em gelo seco. Uma vez que o tubo de 50 ML esteja cheio de nitrogênio líquido, adicionamos o extrato de levedura lentamente, de forma sábia ao tubo em incrementos de 1,5 mililitro. Para minimizar a formação de grandes pelotas de pipoca, a suspensão da levedura é adicionada em um movimento circular.
Para evitar ainda a formação de grandes pelotas de pipoca, usamos grandes fórceps para garantir que todas as pelotas estejam entre 0,3 e 0,5 centímetros de diâmetro. Como o nitrogênio líquido está sempre evaporando, certifique-se de reabastecer o tubo com nitrogênio líquido antes de adicionar cada 1,5 mil alíquotas de suspensão de levedura. Uma vez que toda a suspensão da levedura tenha sido feita em pipoca, permita que o tubo com pipoca fique sem a tampa por dois a três minutos para deixar que todo o nitrogênio líquido residual evaporasse.
Para ter certeza de que todo o nitrogênio líquido evaporou, feche a tampa quase completamente e agite suavemente. Se há um ruído de assoante, indica que o nitrogênio líquido ainda não evaporou completamente. Abra a tampa por mais um minuto ou mais para permitir que o nitrogênio líquido restante evapore antes de fechar a tampa firmemente.
O líquido residual no tubo pode causar uma explosão se a tampa for fechada prematuramente. Esta pipoca de levedura pode ser armazenada quase indefinidamente em menos 80 graus C.Para pelo menos cinco amostras, certifique-se de que você tenha 30 a 35 litros de nitrogênio líquido disponíveis. Encha o moinho de congelador na linha completa e feche a tampa para permitir que o moinho de congelador esfrie por alguns minutos.
Mais uma vez, lembre-se sempre de usar equipamento de proteção pessoal ao lidar com nitrogênio líquido. Os frascos de moagem de policarbonato, os plugues de extremidade de aço inoxidável e a barra de impacto deve ser pré-refrigerado com nitrogênio líquido. Mantenha esses componentes submersos até que o nitrogênio líquido pare de borbulhar.
Lembre-se de manter todas as amostras de pipoca em gelo seco até que todo o processo de moagem esteja completo. Retire todo o nitrogênio líquido dos frascos de moagem e transfira sua pipoca para o frasco. Não se esqueça de colocar uma barra de impacto magnético no frasco de moagem também.
Sele o frasco de moagem colocando cuidadosamente o plugue de aço inoxidável uniformemente na extremidade do frasco de moagem. Nós batemos cada extremidade do frasco de moagem em uma tábua de madeira com uma vibração absorvendo apoio de borracha para garantir que os plugues finais sejam colocados corretamente e estejam selando os frascos de moagem firmemente. É importante fixar os plugues finais para garantir que eles não se soltem e permitam que as amostras derramem no moinho de congelador durante o processo de moagem.
Coloque um frasco de moagem na câmara de moagem do moinho de congelador e bloqueie no lugar. Feche a tampa do moinho de congelador e triture a amostra por três ciclos a dois minutos por ciclo, a uma taxa de esmagamento de 14. Após os ciclos de moagem estiverem completos, desbloqueie o frasco com o lise de células congeladas em pó.
Para evitar que o lisato descongele, trabalhe de forma rápida e cuidadosa para desaparafusar um dos plugues finais usando a ferramenta de abertura. Uma vez que o frasco esteja aberto, remova a barra impactor e transfira rapidamente o extrato de pó congelado em um prato de pesagem de plástico pré-refrigerado. Recupere o máximo possível do extrato congelado batendo o frasco na tábua de madeira.
Uma vez que todo o pó é removido do frasco, transfira rapidamente todos os extratos de pó em um tubo pré-rotulado de 15 mil mantidos em gelo seco. Embora seja melhor prosseguir com o descongelamento e o uso dos extratos imediatamente para minimizar a degradação da proteína, o liseto em pó congelado pode ser armazenado durante a noite a menos 80, se necessário. Descongele o pó lentamente em um chorume de gelo que é continuamente circulado usando uma barra de agitação magnética em um balde de gelo.
Para facilitar até mesmo o descongelamento, remova o gelo que se desenvolve na parte externa dos tubos com frequência, cerca de cinco minutos ou mais. Uma vez que os extratos começam a descongelar no coquetel inibidor de protease 1X e 10 micromolars proteasome inibidor MG132 para evitar a degradação da proteína. Uma vez que as amostras estejam completamente descongeladas, o que pode levar mais de uma hora, gire as amostras a 3.220 G por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Este giro removerá a maioria dos detritos celulares do liseto. Quando o giro estiver completo, transfira o supernatante em garrafas de policarbonato que foram pré-refrigerados no gelo e descarte a pelota. Centrifugar o supernato e amostras a 16.000 G a quatro graus Celsius por 20 minutos para esclarecer o extrato.
Após a rotação estar completa, recupere apenas o supernatante claro cuidadosamente do meio da coluna líquida sem perturbar a camada nublada que contém a peça em cima ou os detritos pelleted na parte inferior do tubo de centrífuga. Transfira o lise claro para um tubo fresco pré-refrigerado de 15 Mil. O líquido nublado restante pode ser recentementerifuado por cinco minutos na mesma velocidade para permitir a recuperação de um pouco mais do lysate atacado.
Os extratos estão agora prontos para uso em experimentos, como purificação de complexos proteicos e imunoprecipitação. Comparamos dois métodos diferentes de lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a quatro Celsius e um método automatizado de moagem crio em menos 196 Celsius para avaliar as proteínas relativas recuperadas e extratos celulares preparados com ambos os métodos. A partir deste estudo, optamos por usar uma cepa de levedura brotante carregando uma cópia alta plasmid expressando uma ubiquitina marcada por HIS-MYC.
Assim, podemos avaliar a afinidade de recuperação de proteínas polibiquitinadas marcadas de extratos por atacado, seguindo a purificação de afinidade usando talon cobalto HIS tag affinity beed seguido por manchas ocidentais com um anticorpo monoclonal HIS tag. Proteínas polibiquitinadas que normalmente são de curta duração devido à sua rápida degradação pelo maquinário proteasome de ubiquitina e, assim, oferecem uma maneira muito boa de comparar a qualidade dos extratos por atacado preparados por diferentes métodos. Como vemos pela metade direita da membrana manchada de Ponceau, recuperamos um maior rendimento total de proteína nos extratos por atacado preparados pelo protocolo da fábrica de congeladores crios, como julgado pela mais intensa mancha de Ponceau em toda a faixa de extrato por atacado.
Isto é especialmente claro nas partes inferior e superior das faixas inteiras de extratos da fábrica de congeladores. Além disso, como mostrado pela metade direita da mancha ocidental his tag, observamos uma melhor recuperação da proteína ubiquitinada his-MYC, seguida por puxar para baixo usando contas talon dos extratos de atacado preparados pela moagem criogênica. Concluímos que a fábrica de congeladores criogênicos é superior a outros métodos para a preparação de extratos celulares, especialmente quando macromoléculas funcionais são necessárias para a aplicação a jusante.
