Дрожжи является популярным модель организма, а не только для генетических исследований, но и для биохимических исследований белков и других макромолекул, извлеченных из дикого типа и мутантных штаммов дрожжей. Однако, из-за их жесткие стенки клеток, основная проблема, с которыми сталкиваются исследователи это эффективный лиз дрожжевых клеток, не повреждая содержание клеток. Изоляция нетронутых биологических макромолекул обычно имеет решающее значение, зависит от температуры.
Подготовка экстрактов при низкой температуре гарантирует, что внутриклеточные протеазы и ядра остаются неактивными, что приводит к надежной изоляции нетронутого белка, нуклеиновых кислот и других макромолекул для достаточного лиза. Различные методы доступны для получения дрожжевых экстрактов с помощью энзиматических, химических и физических лиза. Однако ферментативныйлиз стоит дорого из-за необходимости очищенных ферментов переваривать клеточной стенки, тем самым ограничивая использование меньшего количества клеток.
Далее энзиматические реакции должны быть тщательно проверены, чтобы предотвратить чрезмерное пищеварение и преждевременныйлиз клеток. Химические методы с использованием сильных денатурированных агентов, хотя и эффективны, приводят к денатурации белков и как таковые, не подходят для изоляции белковых комплексов или функциональных ферментов. Физические методы, такие как лиз под высоким давлением во французской прессе могут быть проведены в холоде при четырех по Цельсию, но это не достаточно холодно, чтобы предотвратить деградацию и денатурацию всех местных белков.
Другие популярные физические методы являются использование раствора и пестика, блендер, или кофемолка молоть дрожжевых клеток resuspended в буфере лиза и замороженные в виде капель или шлифования и смеси стеклянных бусин и дрожжей в быстрой подготовки бисера загонщик мельницы или лиза по sonication. Тем не менее, ручная шлифовка является трудоемким и в результате выход белка может значительно варьироваться в зависимости от методов, используемых в то время как лиза по sonication или шлифовальные в блендере, кофемолка, или бисероплетение мельница генерирует значительное количество тепла, что приводит к денатурации белка и деградации. Поэтому для получения лиза дрожжевых клеток с белками в их родном состоянии с минимальной денатурацией и деградацией для таких применений, как очистка функциональных белковых комплексов, биохимические анализы или обнаружение мимолетных пост-трансляционных модификаций, необходимо использовать легко масштабируемый метод лиза, который позволит свести к минимуму выработку тепла, позволяя при этом эффективное лиз независимо от количества клеток.
Здесь мы описываем метод, который включает в себя использование крио морозильной мельницы для лиза клеток в жидком азоте при минус 196 по Цельсию для генерации замороженных клеточных экстрактов, что позволяет восстановление нетронутых функциональных макромолекул, таких как белки или ДНК и РНК, при очень низких температурах, что сводит к минимуму денатурацию и деградацию. Этот метод может быть легко адаптирован для использования с любым типом клеток или тканей образца из любых видов, в том числе судебно-медицинских и даже древних образцов, найденных из археологических памятников или нашли замороженные в вечной мерзлоте. Морозильная мельница использует сверхпроводящую электромагнитную шлифовальную камеру, которая быстро перемещает твердый металлический бар туда и обратно в файле поликарбоната, содержащем образец, который будет распылен между пробками из нержавеющей стали.
Этот метод физического лиза клеток позволяет более эффективно лиза и воспроизводить приводит к лучшему качеству экстракта. Дрожжевые клетки были выращены в концентрации 10 миллионов клеток на мил. Эти дрожжевые клетки были помещены предварительно охлажденной бутылки центрифуги и были закручены в течение 10 минут на 2, 400 Г.Как только спина завершена, декантировать супернатант, не нарушая гранулированных клеток.
Эта гранула была повторно использована в небольшом количестве ледяной воды, около половины первоначального объема культуры для мытья клеток. Повторноеsuspended клетки были снова вращаться вниз еще на 10 минут на 2, 400 G.Once следующий спин завершен, мы, опять же, decant все супернатанты, не нарушая гранулы. Затем эта гранула будет перерасходована и 15 МЛ буфера ледяного лиза.
Убедитесь, что гранулы полностью перерасход. Повторно натязаемые клетки должны оставаться на льду в предварительно обозначенной трубке до готовности к следующему шагу. Всегда носите средства индивидуальной защиты при обращении с жидким азотом, такие как защитные очки, защита рук и лабораторные пальто.
Чтобы максимизировать нашу ловкость, мы часто носим пару белых тепловых перчаток, зажатых между двумя парами нитриальных перчаток. Изменение внешних и нитрил перчатки часто, так как они рип легко после воздействия жидкого азота. В нашей лаборатории мы переадим алицит жидкого азота в небольшой пятилитровый контейнер с жидким азотом.
Затем жидкий азот выливается в трубку 50 ML, которая предварительно охлаждается на сухом льду. После того, как 50 ML трубка полна жидкого азота, мы добавляем дрожжевой экстракт медленно, в капле мудрым образом в трубку в 1,5 миллилитров шагом. Чтобы свести к минимуму образование крупных гранул попкорна, дрожжевой суспензии добавляется круговыми движениями.
Для дальнейшего предотвращения образования крупных гранул попкорна, мы используем большие типсы, чтобы убедиться, что все гранулы между 0,3 и 0,5 сантиметров в диаметре. Поскольку жидкий азот всегда испаряется, не забудьте пополнить трубку жидким азотом, прежде чем добавлять каждые 1,5 млн aliquot дрожжевой суспензии. После того, как все дрожжи подвеска была сделана в попкорн позволяют трубку с попкорном сидеть без крышки в течение двух-трех минут, чтобы все остаточные жидкий азот испаряться.
Чтобы убедиться, что весь жидкий азот испарился, закройте крышку почти полностью и встряхните осторожно. Если есть шум, указывающий на то, что жидкий азот еще полностью не испарился. Откройте крышку еще минуту или около того, чтобы оставшийся жидкий азот испаряется перед закрытием крышки плотно.
Остаточная жидкость в трубке может вызвать взрыв, если крышка закрыта преждевременно. Этот дрожжевой попкорн может храниться почти бесконечно в минус 80 градусов по Цельсию.По крайней мере пять образцов, убедитесь, что у вас есть от 30 до 35 литров жидкого азота доступны. Заполните морозильную мельницу до полной линии и закрыть крышку, чтобы морозильная мельница предварительно охладить в течение нескольких минут.
Опять же, всегда помните, носить средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом. Поликарбонат шлифовальные флаконы, вилки из нержавеющей стали конца, и ударник бар должен быть предварительно охлажден жидким азотом. Держите эти компоненты погруженными до тех пор, пока жидкий азот не перестанет пузыриться.
Не забудьте сохранить все образцы попкорна на сухом льду, пока весь процесс шлифования не будет завершен. Вытащите весь жидкий азот из шлифовальных флаконов и перенесите попкорн во флакон. Не забудьте поместить магнитный ударный бар в шлифовальный флакон, а также.
Печать шлифовальный флакон, тщательно поместив вилку из нержавеющей стали равномерно на конце шлифовального флакона. Мы взрыва каждого конца шлифовального флакона на деревянной доске с вибрацией поглощающей резиновой поддержки для обеспечения того, чтобы конечные пробки размещены правильно и уплотнения шлифовальные флаконы плотно. Важно, чтобы обеспечить конец пробки, чтобы убедиться, что они не будут свободно и позволяют образцам разлива в морозильной камере мельницы во время процесса шлифования.
Поместите шлифовальный флакон в морозильной камере мельницы шлифовальной камеры и замок на месте. Закройте крышку морозильной камеры и измельчите образец в течение трех циклов по две минуты за цикл, с дробильный скоростью 14. После измельчения циклов полного разблокировать флакон с замороженным порошковой ячейки лизолировать.
Чтобы предотвратить лизировать от оттаивания, работать быстро и осторожно, чтобы отвинтить один из конечных пробок с помощью инструмента открытия. Как только флакон открыт, удалите ударный бар и быстро перенесите замороженный экстракт порошка на предварительно охлажденную пластиковую тарелку для взвешивания. Восстановить как можно больше замороженных экстрактов, как это возможно, стучать флакон на деревянной доске.
После того, как весь порошок удаляется из флакона, быстро передать все порошковые экстракты в предварительно помечены 15 мил трубки хранится на сухом льду. Хотя лучше всего приступить к оттаиванию и использовать экстракты сразу, чтобы свести к минимуму деградацию белка, замороженный лизат порошка может храниться на ночь при температуре минус 80, если это необходимо. Оттепель из порошка лизировать медленно в ледяной суспензии, которая постоянно циркулирует с помощью магнитного перемешать бар в ведро со льдом.
Чтобы облегчить даже оттаивание, удалить лед, который развивается на внешней стороне труб часто, примерно каждые пять минут или около того. Как только экстракты начинают оттаивать при 1X ингибиторе протеазы и 10 микромоляных протеасомных ингибиторах MG132 для предотвращения деградации белка. После того, как образцы полностью разморожены, что может занять более часа, спина вниз образцов на 3, 220 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Этот спин будет удалить большую часть клеточного мусора из лисата. Когда спина завершена передача супернатанта в поликарбонат бутылки, которые были предварительно охлажденной на льду и отказаться от гранул. Центрифуга суперната и образцов на 16000 G при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы прояснить экстракт.
После того, как спина завершена, восстановить только ясно supernatant тщательно из середины жидкой колонки, не нарушая облачный слой, содержащий кусок сверху или pelleted мусора в нижней части центрифуги трубки. Перенесите чистый лизат в свежую предварительно охлажденную трубку 15 Mil. Оставшаяся мутная жидкость может быть recentrifuged в течение пяти минут с той же скоростью, чтобы восстановление еще несколько оптовых лисации.
Экстракты теперь готовы к использованию в экспериментах, таких как очистка белковых комплексов и иммунопреципиентация. Мы сравнили два различных метода лиза дрожжевых клеток, а именно фрезерование стеклянной бисера при четырех по Цельсию и автоматизированный метод крио шлифования при минус 196 по Цельсию для оценки относительно восстановленных белков и клеточных экстрактов, приготовленных обоими методами. Из этого исследования мы решили использовать начинающий штамм дрожжей проведения высокой плазмидной копии выражая тандем HIS-MYC помечены убиквитина.
Таким образом, мы можем оценить сродство восстановления помеченных полиубикотинированных белков из оптовых экстрактов, после сродства очистки с помощью TALON кобальта его тег сродство бисера следуют западные blotting с моноклональным его тег антитела. Полиубикитинированные белки, которые, как правило, очень недолговечны из-за их быстрой деградации убиквитином протеасомным механизмом и, таким образом, предлагают очень хороший способ сравнить качество оптовых экстрактов, подготовленных различными методами. Как мы видим, по правой половине Ponceau окрашенных мембраны, мы восстановили более высокую общую урожайность белка в оптовых экстрактов, подготовленных крио морозильник мельницы протокола, как судить по более интенсивным Ponceau окрашивания всей оптовой полосе экстракта.
Это особенно ясно в нижней и верхней частях морозильной мельницы целые экстракты полос. Кроме того, как показала правая половина его тега Западной пятно, мы наблюдали лучшее восстановление HIS-MYC тег убиквитинированный белок с последующим стащить с помощью Talon бисера из оптовых экстрактов, подготовленных криогенной шлифования. Мы приходим к выводу, что криогенная морозильная фабрика превосходит другие методы подготовки клеточных экстрактов, особенно когда функциональные макромолекулы необходимы для применения ниже по течению.
