المصممة حديثا سينكروترون الأشعة السينية الفلوريسنس نانو تحقيقات تسمح التصور من التوزيع عنصري لعينة. استخدام النهج المبردة إلزامي لإبطاء الأضرار الإشعاعية بالأشعة السينية. ولذلك، فإن التبريد السريع ضروري للحصول على الخلايا المائية المجمدة لتحسين الحفاظ على بنية الخلية وسلامتها الكيميائية.
خصوصية الاستعدادات الخلوية لدراسات السنكروترون تؤدي إلى تحسين هذا البروتوكول للحصول على monolayers الخلية المرطبجة المجمدة. العرض التوضيحي المرئي مهم لفهم كيفية التعامل مع عينات أحادية الطبقة الخلية لتحقيق خلايا مُكَرَبة مُكَرَبة مُضمنة ضمن طبقة رقيقة من الجليد. لإعداد دعم غشاء نيتريد السيليكون، افتح الكبسولة التي تحتوي على دعم الغشاء وضغط بلطف على الكبسولة لتخفيف الدعم بخفة.
استخدام ملاقط رقيقة لفهم زاوية واحدة من إطار السيليكون مع الحرص على عدم لمس غشاء نيتريد السيليكون في وسط الإطار ووضع الإطار في طبق بيتري كشف في مجلس الوزراء تدفق لارينار. ثم تعقيم الأشعة فوق البنفسجية الغشاء لمدة 25 إلى 30 دقيقة. في نهاية التعقيم، إضافة 10 ميكرولترات من عامل المرفق مثل بولي-L-ليسين.
احتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. ثم ملء آبار صفيحة 48-جيدا مع 200 إلى 250 ميكرولتر من 0.22 ميكرومتر تصفية المياه نقية جدا و ultras ultra ونقية في كل بئر. استخدام ملاقط غرامة لغمر بعناية الغشاء عموديا مع ثلاثة شطف متتالية 10 ثانية في بئر واحدة من الماء.
بعد الشطف، ضع الغشاء عموديا في بئر فارغة من صفيحة 96-جيدا عقيمة تحت غطاء محرك التدفق الفاتن واتركه بين عشية وضحاها حتى يجف. لبذات الخلايا من الفائدة، وضع الغشاء المغلفة مع الجانب المسطح التي تواجه في بئر واحد من لوحة أربعة-بئر عقيمة. إضافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الأربع في 10 ميكرولترات من متوسطة مناسبة للثقافة إلى سطح غشاء نيتريد السيليكون دون لمس الغشاء.
وينبغي أن القطرة تغطي الغشاء بأكمله. ثم زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. عندما بدأت الخلايا في التعلق بالركيزة ، أضف ببطء ملليلتر واحد من المتوسط الكامل للثقافة أسفل جدار كل بئر يغطي كل غشاء.
ثم زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. للتبريد من إعداد الخلوية، أولا بدوره على الفريزر يغرق التلقائي وملء العدد المناسب من الآبار في لوحة بلاستيكية 12-جيدا مع 37 درجة مئوية الأمونيوم خلات العازلة. مباشرة قبل الشطف والغطس تجميد الغشاء، وإزالة العينة من الحاضنة واستخدام حلقة المشبك الأسود من زوج من ملاقط الإفراج السريع لفتح ملاقط.
استخدام ملاقط مقفلة لفهم دعم الغشاء وتزج الغشاء عموديا داخل محلول العازلة خلات الأمونيوم لمدة خمس ثوان تقريبا. لإزالة أي العازلة الزائدة، اضغط على الجزء السفلي من دعم الغشاء على ورقة التصفية ولطخة كل جانب من الإطار على ورقة التصفية دون السماح للغشاء للمس ورقة. عندما تم إزالة العازلة الزائدة، وفتح باب غرفة البيئية، حرك بسرعة الملاقط في تعشيق ملقط، وإغلاق باب الغرفة.
اضغط على لطخة هبوط. الملاقط التي تحمل غشاء نيتريد السيليكون سوف تغرق بسرعة في cryogen. بعد الغطس تجميد، وإزالة غطاء حاوية نقل مع ملقط قبل تبريد ونقل الصحافة.
سيتم نقل غشاء نيتريد السيليكون قليلا فوق الكريوجين. في حركة واحدة سريعة، والانزلاق وإمالة قليلاً ملاقط من تعشيق ملقط لجلب ملاقط مباشرة إلى فتحة فارغة من صندوق التبريد في حاوية نقل مليئة السائل النيتروجين. ثم حرر حلقة المشبك الأسود لتحرير الغشاء.
لتجميد تجفيف الخلايا المتجمدة يغرق، استخدم مفتاح الروك الموجود على اللوحة الخلفية لأداة تجميد التجفيف إلى السلطة على الصك. ستظهر الشاشة الضغط على إدخال عندما تكون جاهزة لتحميل العينة. جبل السيليكون نيتريد غشاء النحاس حامل على رأس حامل نقل العينة المقدمة من المورد في حاوية تخزين البوليسترين حفظ مستوى النيتروجين السائل إلى حوالي 1-2 ملليمتر تحت الحافة العليا من أول قطعة النحاس.
وضع الغشاء مع الجانب عينة الخلية التي تواجه في تجويف حامل النحاس المرقم وpre-cool قضيب نقل في مربع رغوة البوليسترين السائل مملوءة بالنيتروجين. استخدام قضيب لقفل في التجمع الكامل، اضغط على دخول لكسر الفراغ للافراج عن غطاء غرفة مجفف تجميد، ونقل على الفور العينة في غرفة مجفف تجميد، وإغلاق غطاء غرفة مجفف تجميد. ثم اضغط على الفور ابدأ في الاستمرار في دورة التجفيف تجميد.
في نهاية دورة التجفيف تجميد، اضغط على وقف لتنفيس الغرفة وإزالة التجمع الكامل للوصول إلى عينات تجميد المجففة. هنا عرض نموذجي مجهر الفيديو البصرية من خلايا خلية سرطان الثدي المجمدة خلية فرعية استزراع على بولي-L-ليسين المغلفة السيليكون نيتريد دعم غشاء كما هو مبين. يكشف رسم خرائط الفلوراسين الشعاعي بالأشعة السينية للخلايا المرطبية المجمدة عن توزيع العناصر الفسيولوجية مثل البوتاسيوم والكبريت والزنك.
في هذا المثال التمثيلي، تم توزيع عنصر الكبريت المقيد بإحكام داخل الخلية في نمط مماثل لذلك الملاحظ للبوتاسيوم ويمثل تقديرًا جيدًا لملف تعريف الكتلة الخلوية. ومع ذلك، أظهر توزيع الزنك إشارة أعلى داخل النواة مما هو عليه في السيتوسول مع فصل محدد بوضوح للإشارة بين السيتوسول ونواة. في هذا العرض المجهري النموذجي لـ Brightfield من الخلايا العصبية فرس النهر الأولية المجففة بالتجميد المستزرعة مباشرة على غشاء نيتريد السيليكون كما هو موضح ، تظهر الخلايا مورفولوجيا عصبية نموذجية لا تتأثر بثقافتها أو طريقة الحفظ.
كما يكشف التصوير المفلور بالأشعة السينية للخلايا المجمدة من توزيعات عنصرية نموذجية كما تظهرها هذه الخلايا المجففة بالتجميد التمثيلية بدقة مكانية من 50 إلى 100 نانومتر. رسم نافذة نيتريد السيليكون أمر بالغ الأهمية للحصول على أنحف طبقة الجليد ممكن من الخلايا بعد الغطس تجميد. الحفاظ على السلامة الكيميائية للخلايا على المستوى دون الخلوية يسمح للمعادن من الخلايا التي يمكن استكشافها مع مسابير نانو السنكروترون وكذلك مع تقنيات أخرى microanalytical.
كما لا يمكن إجراء كل تحليل المسبار النانوي السنكروترون في درجة حرارة المبردة، يمكن أن تكون الخلايا المائية المجمدة مزيد من تجميد المجففة لتسهيل تحليلها في درجة حرارة الغرفة. تذكر أن تستخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل واستخدام غاز الإيثان دائمًا في غطاء الدخان بعيدًا عن اللهب.
