يمكن استخدام هذا البروتوكول لتطبيق محلل تدفق خارج الخلية لمراقبة التغيرات في استقلاب الطاقة أثناء سعة الحيوانات المنوية. لقد قمنا بتطوير هذا البروتوكول لمقارنة التغيرات في تحلل الجلوكوز والفوسفور التأسد في الوقت الحقيقي بين الحيوانات المنوية الماوس غير القدرات والقدرات. في اليوم السابق للمقايسة، قم بإزالة خرطوشة المستشعر من مجموعة فحص خارج الخلية ووضع الكارتريدج رأسًا على عقب بجوار لوحة الأدوات المساعدة.
ملء خزان حل مع 25 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة وإضافة 200 ميكرولترات من الماء إلى كل بئر من لوحة فائدة، ثم وضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى في لوحة فائدة. ضع الطبق في حاضنة لثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، aliquot 25 ملليلتر من محللات تدفق خارج الخلية calibrant في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ووضع الأنبوب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية.
لإعداد لوحات دقيقة مغلفة ConA ، حل 2.5 ملليغرام من كونا في خمسة ملليلتر من الماء المقطر المزدوج واستخدام ماصة متعددة القنوات لملء كل بئر من محلل تدفق خارج الخلية 96-well plate مع 50 ميكرولترات من حل ConA ، ثم اترك الغطاء مفتوحًا للسماح للصفيح بالجفاف بين عشية وضحاها. لإعداد العازلة الحيوانات المنوية، سخني 250 ملليلتر من محلل تدفق خارج الخلية TYH العازلة إلى 37 درجة مئوية وضبط درجة الحرارة إلى 7.4. في يوم الفحص، استبدل الماء في كل بئر من ألواح المرافق بـ 200 ميكرولتر من xF calibrant لكل بئر ووضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة على الأقل.
لإنشاء قالب موجة، قم بتشغيل محلل تدفق خارج الخلية. في حين أن درجة الحرارة تستقر إلى 37 درجة مئوية ، افتح برنامج الموجة وافتح قالبًا فارغًا. تحت علامة التبويب تعريفات المجموعة، تعريف الوسيطة المقايسة مثل TYH ونوع الخلية كالحيوانات المنوية الماوس، وترك استراتيجيات الحقن و ما قبل المعالجة فارغة.
إنشاء مجموعات مختلفة لكل شرط فحص وفتح خريطة لوحة لتعيين كل مجموعة لآبار محددة. تحت علامة التبويب بروتوكول، unhighlight الإزدلال، إضافة كل من أربع دورات قياس مختلفة، حدد المنفذ المعني، وتحرير تفاصيل القياس بحيث يتم تمييز قياس بعد الحقن، ثم حفظ قالب الفحص، وملء ملخص المشروع وحفظ النتائج. قبل حصاد الحيوانات المنوية، قبل 50 ملليلتر من عازلة TYH في 37 درجة مئوية.
بعد حصاد الاكواس من الفئران الذكور البالغين، ضع كل كودا في 500 ميكرولترات من عازل TYH الدافئ مسبقًا في آبار فردية من طبق 24 بئرًا. استخدام ملقط لشل كل كودا بشكل فردي في الجزء السفلي من كل بئر وجعل بسرعة خمسة إلى سبعة شقوق صغيرة في كل نسيج باستخدام مقص الريش. عندما تم قطع جميع الكوداس ، ضع على الفور اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير للسماح للحيوانات المنوية بالتفرق لمدة 15 دقيقة.
لتحميل خرطوشة المستشعر، قم بإزالة الغطاء من خرطوشة المستشعر ومحاذاة حرف دليل تحميل المنفذ مع الزاوية اليسرى العليا من الكارتريدج. عقد دليل تحميل الميناء في مكان، إدراج نصائح ماصة عموديا في الثقوب دليل تحميل الميناء من ميناء A وحقن 20 ميكرولترات من العازلة TYH في كل عمود. بالنسبة للميناء B، حقن 22 ميكرولترتر من العازل TYH في أعمدة واحد من خلال أربعة، 22 ميكرولترات من 500 ملليمولار 2-deoxyglucose في أعمدة من خمسة إلى ثمانية، و 25 ميكرولترات من خمسة مضادات ميكرومولار A rotenone في أعمدة من تسعة إلى 12.
لميناء C، حقن 25 ميكرولترات من العازلة TYH في كل عمود مع أرقام فردية و 25 ميكرولترات من 10 ملليمولار من ثنائي بوتيل دوري AMP 500 IBMX ميكرومولور في كل عمود مع أرقام حتى، ثم ضع خرطوشة الاستشعار مع لوحة المعايرة في محلل تدفق خارج الخلية والبدء في الفحص. ستستغرق المعايرة من 10 إلى 15 دقيقة. لإعداد لوحات الحيوانات المنوية، إضافة ثلاثة ملليلتر من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر البوم الدم البقري في TYH العازلة إلى كل من ثلاثة خمسة أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر.
بعد ذلك، تجمع بئرين من الحيوانات المنوية في كل من ثلاثة أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بعد العد، وتمييع الحيوانات المنوية إلى مرتين 10 إلى سبعة الحيوانات المنوية في المليلتر تركيز لكل عينة في TYH الطازجة تستكمل مع الألبومين مصل البقر. رواسب الحيوانات المنوية عن طريق الطرد المركزي و resuspend الكريات الحيوانات المنوية في ملليلتر واحد من العازلة TYH.
الطرد المركزي الحيوانات المنوية مرة أخرى وإزالة superants مع الحرص على عدم إزعاج الكريات. نقل كل تعليق الحيوانات المنوية في واحدة من خمسة أجهزة الطرد المركزي المليتر أعدت أنابيب وإضافة 180 ميكرولترات من العازلة TYH في كل ركن من البئر من لوحة مغلفة ConA. إضافة 180 ميكرولترات من الحيوانات المنوية في كل بئر فارغة من لوحة المغلفة كونا والطرد المركزي لوحة مرتين تناوب لوحة 180 درجة بين الطرد المركزي، ثم وضع لوحة المعايرة مع لوحة الحيوانات المنوية ومواصلة الفحص.
في هذه التجربة التمثيلية، تم تهيّم الحيوانات المنوية في وجود الجلوكوز باعتباره الركيزة الوحيدة للطاقة و2-ديوكسيغلوكوز والأتنيميين والروتينون كمعودات دوائية. يشير السهم إلى الحث على السعة. في وجود الجلوكوز ، ورافق القدرات من قبل زيادة سبعة أضعاف في معدل التحمض خارج الخلية التي يتم تثبيطها عن طريق منع تحلل الجلسان مع 2-deoxyglucose.
أظهرت الحيوانات المنوية ذات القدرات زيادة 20 ضعفًا في معدل استهلاك الأكسجين مقارنة بالحيوانات المنوية غير ذات القدرات مما يدل على أن الحيوانات المنوية الماوس تعزز كل من تحلل الجلوكوز والفوسفور التأكسي لدعم الطلب المتزايد على الطاقة أثناء القدرة. لا يتأثر ارتفاع معدل التحمض خارج الخلية أثناء سعة الحيوانات المنوية بمثبطات الفسفور المؤسدة أنتيميسين A والروتينون مما يشير إلى أن التغيير في هذا المعدل مدفوع بشكل رئيسي بإطلاق الهيدروجين من تحلل الجلوكوز. ومع ذلك، يتم حظر الزيادة في معدل استهلاك الأكسجين بواسطة أنتيوميسين A و rotenone وكذلك من قبل 2-deoxyglucose تكشف عن أن الزيادة في OXPHOS أثناء قدرة الحيوانات المنوية تعتمد على النشاط الجليكية.
يمكن أن يختلف مصدر الطاقة و المنشطات الصيدلانية والمثبطات اعتمادا على هدف التجربة ويمكن قياس ما يصل إلى 12 حالة مختلفة بالتوازي. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع الأنواع الأخرى مثل الإنسان أو البقر حيث تكون التغيرات في استقلاب الطاقة أثناء السعة غامضة على قدم المساواة.
