هذا البروتوكول يسمح لنا لعزل وثقافة عالية ثنائي BBT، والمعروف فقط إلى القلب الماوس. لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، يمكن تحليل معدل استهلاك الأكسجين من عضلة القلب من قبل محلل تدفق الفضة الفعلية. واحدة من مزايا هذه التقنية هو أن استهلاك الأكسجين من cardiomyocytes يمكن قياسها بسهولة في الدولة التي تضمها في شكل 96-جيدا، مما يتيح اختبار ظروف متعددة مع عدد كبير من النسخ المتماثلة.
يوفر هذا الوعاء رؤى مهمة في مجال البحث في أمراض القلب. بالإضافة إلى استهلاك الأكسجين، يمكننا أيضا دراسة المعلمات الأيضية الأخرى، مثل الزجرية و الايبوكسيد peracid. تحقيق تباين عالية من cardiomyocytes أمر بالغ الأهمية لهذه التجربة.
وهذا يتطلب هضم فعال للقلوب. منذ نيو ناو الولادة cardiomyocytes هشة جدا، التعامل لطيف من cardiomyocytes مهم أيضا. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، aliquot 5ml من HBSS إلى كل بئر من لوحة ثقافة خلية 6-جيدا ووضعها على الجليد.
وبالإضافة إلى ذلك، aliquot 10ml من HBSS إلى طبق ثقافة الخلية 10cm، ثم، وإعداد 20 مل من محلول Predigestion تريبسين في أنبوب مخروطي معقم 50ml. الحفاظ على جميع الحلول على الجليد. بعد ذلك، استخراج القلب ونقله على الفور إلى طبق ثقافة الخلية العقيمة التي تحتوي على HBSS.
إزالة أي أنسجة الرئة المتبقية والأوعية الكبيرة. اغسل القلب في HBSS باستخدام الانفعالات اللطيفة. في وقت لاحق، وقطع القلب مع مقص غرامة إلى 8 قطع ونقل أنسجة القلب مع ملقط في بئر واحد من 6-جيدا خلية لوحة ثقافة مع HBSS.
باستخدام ملعقة موريا، وغسل أنسجة القلب عن طريق نقله من جيد إلى جيد في لوحة 6-جيدا مليئة HBSS. ثم نقل أنسجة القلب إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 20ml من تريبسين واحتضان مع التحريض لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. في هذا الإجراء، قبل الدفء الحل الهضم collagenase في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
نقل أنبوب مخروطي يحتوي على أنسجة القلب وحل ما قبل عسر الهضم من 4 درجات مئوية إلى غطاء الخلية ثقافة. دع أنسجة القلب تغرق في قاع الأنبوب وأزل محلول ما قبل عسر الهضم باستخدام ماصة مصلية 10 مل. المقبل، إضافة 10ml من HBSS في أنبوب.
Resuspend أنسجة القلب مع HBSS 2 إلى 3 مرات لغسل التربسين باستخدام ماصة المصلية 10ml. سبيرات HBSS وإضافة 10ml من حل الهضم الكولاجين قبل الدفء في أنبوب مع أنسجة القلب. لعملية الهضم الأولى، احتضان الأنبوب مع أنسجة القلب في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق دون تحريض.
بعد ذلك، نقل أنبوب إلى غطاء الخلية ثقافة. إعادة تاليل الأنسجة عن طريق إعادة تعليقها بلطف 10 مرات باستخدام ماصة 10ml المصلية. وهذا سيسمح للقلب لتفريق والخلايا التي سيتم تحريرها من أنسجة القلب.
دع الأنسجة غير المهضومة تغرق نقل الحل المهضم المخصب في cardiomyocytes إلى أنبوب مخروطي جديد وعلى الفور إضافة كمية متساوية من خلية ثقافة المتوسطة لوقف هضم الكولاجيناز. ثم إضافة 10ml من حل الهضم collagenase في أنبوب يحتوي على أنسجة القلب المتبقية غير مهضومة.
للهضم الثاني، احتضان أنبوب مع أنسجة القلب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. كرر إجراءات الهضم الأول ونقل الحل المهضم المخصب في عضلة القلب إلى أنبوب مخروطي جديد قبل وقف هضم الكولاجيناز. المقبل، وضع مصفاة خلية معقمة في أنبوب مخروطي معقم جديد 50ml.
قبل الرطب مصفاة الخلية مع 2 إلى 3 مل من خلية ثقافة المتوسطة وتمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية. في وقت لاحق، شطف مصفاة الخلية مع خلية ثقافة المتوسطة. ثم، الطرد المركزي أنبوب مخروطية تحتوي على cardiomyocytes لمدة 5 دقائق في 180 مرة الجاذبية.
بعد 5 دقائق، الطامح من عظمى و resuspend بيليه الخلية في 10ml من خلية ثقافة المتوسطة. لوحة الخلايا على طبق ثقافة الخلية 10cm واحتضانها لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، يهيج بلطف لوحة.
غسل قبالة الخلايا غير أتباع وإعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا متوسطة ثقافة الخلية على الطبق باستخدام ماصات المصلية 10ml. ثم، نقل الخلايا غير أتباع في طبق ثقافة خلية 10cm جديدة واحتضان لهم لمدة ساعة أخرى. بعد ساعة ، يهيج الطبق بلطف ويغسل الخلايا غير المنضمة.
نقل القلبيات القلبية إلى أنبوب مخروطي جديد 50ml. المقبل، وإعداد لوحة ثقافة 96-well عن طريق الاقتباس 50 ميكرولترات من حل الطلاء في كل بئر من لوحة ثقافة الخلية 96-well. إذا كانت الفقاعات موجودة، إزالتها باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح لتجفيف طلاء المصفوفة. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. لوحة الخلايا في المصفوفة خارج الخلوية المغلفة 96 جيدا خلية لوحة ثقافة في كثافة بين 10 إلى 30 ألف خلية في البئر.
ووضع الخلايا في الاحتضان. لتشخيط فحص استهلاك الأكسجين، ترطيب خرطوشة استشعار محلل تدفق لمدة 3 ساعات على الأقل، إضافة 200 ميكرولترات من حل الكاليبانت في كل بئر من لوحة فائدة. ضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى على لوحة المرافق وتحتضن في 37 درجة مئوية دون مكملات ثاني أكسيد الكربون أو O2 لمدة 3 ساعات على الأقل.
ساعة واحدة قبل الفحص، وإزالة بلطف متوسطة ثقافة الخلية وغسل الخلايا مع 200 ميكرولترات من الإجهاد الميتوكوندريا قبل اختبار المتوسط مرتين. بعد الغسيل الثاني، إضافة 175 ميكرولترات من اختبار الإجهاد الميتوكوندريا قبل الإرهاق المتوسطة. ثم زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية دون ثاني أكسيد الكربون أو مكملات الأكسجين.
إعداد 3ml من كل من مركبات الاختبار في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا المتوسطة. قم بتحميل 25 ميكروليتر لكل مركب في منافذ الحقن لخراطيش الاستشعار باستخدام ماصة متعددة القنوات. حالة الخلايا وأية معالجة مسبقة يمكن أن تؤثر على أقصى قدر من استعادة التي أثارها حقن FCCP uncoupler.
حساسية الخلية إلى uncoupler يمكن أيضا تغيير، وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لتحسين تركيز العمل من FCCP لكل علاج معين. في وقت لاحق، قم بإعداد بروتوكول فحص التدفق الخلوي الإضافي وبدء تشغيل البرنامج. أولاً، ضع جهاز الاستشعار في آلة المعايرة.
استبدال الكاليبريانت لصفيحة مُقايسة مرة واحدة يتم إجراء خطوة المعايرة. إذا رغبت، بعد الفحص، تجاهل بعناية جميع المتوسطة المقايسة باستخدام ماصة متعددة القنوات. وتخزين mircoplate ثقافة الخلية في السلبية 20 درجة مئوية لتطبيع الخلايا في المستقبل باستخدام مقايسة البروتين.
باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم عزل القلوب من اليوم 0 الجراء الجديدة وذريات القلب في كثافات 10 أو 20 أو 30 ألف خلية في البئر في 96 بئر. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، تم العثور على cardiomyocytes تعلق بشكل جيد على سطح البلاستيك المغلفة، وكان هناك عدد قليل جدا من الخلايا غير المرفقة. عند هذه النقطة، التعاقد تلقائيا cardiomyocytes كانت مرئية بسهولة.
وأظهرت كثافة البذر من 30،000 الخلايا في جيدا التقاء بعد يوم واحد من البذر كما تنتشر الخلايا. كانت مناعة Cardiomyocytes مع جسم مضاد ضد ساركMERIC ألفا actinin ، وهو علامة محددة cardiomyocyte. كما هو مبين هنا، أظهرت معظم الخلايا تلطيخ إيجابي من أكتينين ألفا مما يدل على نقاء عالية من عزل cardiomyocyte.
يظهر مخطط واحد نموذجي اختبار الإجهاد الميتوكوندريا هنا. يبدأ اختبار الإجهاد الميتوكوندريا مع قياس خط الأساس لمعدل استهلاك الأكسجين، ويتبع ذلك حقن myosin Oligo الذي يمنع ATPA. ثم، تم حقن عامل فك الارتباط FCCP لقياس معدل استهلاك الأكسجين الأقصى.
وأخيرا، مع حقن اثنين من مثبطات مجمع نقل الإلكترون، التنفس الميتوكوندريا يتوقف تماما وينخفض OCR إلى أدنى مستوى له. للحصول على نتائج متناسقة وقابلة للتكرار. من المهم للغاية تحقيق ارتفاع البقاء على قيد الحياة.
لذلك، من المهم استخدام حديثي الولادة والأنسجة القلبية التعامل بلطف في خلايا القلب. باستخدام خطوط الماوس الجديدة أو الموجودة المعالجة وراثيا، يمكن ترجمة هذه الطريقة بسهولة إلى البيانات التي قد تؤدي إلى فهم آليات جديدة لتنظيم الطاقة الحيوية في القلب. الميتوكوندريا تلعب الأدوار الرئيسية في وظيفة القلب.
نتوقع أن تساعد هذه الطريقة في تحديد المنظمين والممرات الجديدة التي تنظم عملية التمثيل الغذائي المؤكد وإيجاد أهداف علاجية جديدة لعلاج قصور القلب.
