使用细胞外通量分析仪测量小鼠精子发作期间糖解和氧化磷酸化的变化

该协议可用于应用细胞外通量分析仪来监测精子电容过程中能量代谢的变化。我们开发了此方案，以比较非电容和电容小鼠精子之间糖解和氧化磷酸化的变化。在测定前一天，从细胞外通量检测套件中取出传感器盒，将墨盒倒置放在公用电源板旁边。

向溶液储液罐中加满 25 毫升的双蒸馏水，并将 200 微升水添加到公用板的每个井中，然后将传感器盒放回公用板中。将板放入37摄氏度的非二氧化碳培养箱中。接下来，将25毫升的细胞外通量分析仪卡兰特放入50毫升锥形管中，将管放入37摄氏度的非二氧化碳培养箱中。

要准备 ConA 涂层微板，在五毫升双蒸馏水中溶解 2.5 毫克 ConA，并使用多通道移液器将 96 孔外通量分析仪的每口井用 50 微升的 ConA 溶液填充，然后将盖子打开，让板干燥过夜。为了准备精子缓冲液，将250毫升的细胞外通量分析仪TYH缓冲液加热到37摄氏度，将pH调整为7.4。在测定当天，将公用板每井中每井200微升的XF卡兰特水更换，将该水板放回非二氧化碳培养箱至少一小时。

要生成波模板，请打开细胞外通量分析仪。当温度稳定到37摄氏度时，打开波软件并打开一个空白模板。在组定义选项卡下，将检测介质定义为TYH，将细胞类型定义为小鼠精子，使注射策略和预处理空白。

为每个测定条件创建不同的组，并打开板图，将每个组分配给特定的井。在协议选项卡下，取消高光平衡，添加四个不同的测量周期，选择相应的端口，并编辑测量细节，以便突出显示注入后测量，然后保存测定模板，填写项目摘要并保存结果。在收获精子之前，在37摄氏度下预热50毫升TYH缓冲液。

从成年雄性小鼠身上采集出秋千后，将每只卡达放在24孔板的个别井中，将预加热TYH缓冲液的500微升。使用钳子将每根井底部的每个阴唇单独固定，并使用羽毛剪刀在每个组织中快速进行五到七个小切口。当所有的阴极被切入时，立即将盘子放入非二氧化碳培养箱，让精子分散15分钟。

要加载传感器墨盒，请从传感器墨盒中取出盖子，将相应端口加载导轨的字母与墨盒的左上角对齐。将端口装载导轨放置到位，将移液器尖端垂直插入端口 A 的港口装载导孔中，并将 20 微升 TYH 缓冲液注入每列。对于端口 B，将 22 微升 TYH 缓冲液注入第一至四列，将 22 微升 500 毫摩尔 2-脱氧葡萄糖注入列 5 至 8 中，将 5 微摩尔抗霉素 A rotenone 的 25 微升注入列 9 至 12 列。

对于端口 C，将 25 微升 TYH 缓冲器注入每列，其中奇数和 25 微升 10 毫摩尔的二丁二醇-环环放大器 IBMX 到每个列中，具有偶数，然后将带校准板的传感器盒放入细胞外通量分析仪中，然后开始检测。校准需要 10 到 15 分钟。要准备精子板，在TYH缓冲液中加入三毫升三毫克三毫克的牛血清白蛋白，每毫升离心管。

接下来，将两口精子汇集到三个1.5毫升离心管中。计数后，将精子稀释至新鲜TYH中每毫升浓度2倍10至7精子，并辅以牛血清白蛋白。通过离心沉淀精子，将精子颗粒重新悬浮在一毫升TYH缓冲液中。

再次离心精子，取出超级精子，注意不要干扰颗粒。将每个精子悬浮液转移到准备好的五毫升离心管中，并将 180 微升TYH缓冲液加入 ConA 涂层板的每个角落井中。将180微升精子加入 ConA 涂层板的每个空井中，并在离心之间两次将板旋转 180 度，然后将校准板与精子板一起放置并继续测定。

在这个具有代表性的实验中，精子在葡萄糖作为唯一能量基质的情况下进行电容，作为药理调节剂的2-脱氧葡萄糖和抗霉素和罗酮。箭头指示电容感应。在葡萄糖存在的情况下，在葡萄糖作用的同时，细胞外酸化率增加了七倍，通过用2-脱氧葡萄糖阻断糖解抑制了这种增酸率。

电容精子的耗氧率比非电容精子增加了20倍，这表明小鼠精子可增强糖解和氧化磷酸化，以支持电容过程中不断增长的能量需求。精子容塞期间细胞外酸化率的上升不受氧化磷酸化抑制剂抗霉素甲和罗泰诺的影响，表明该速率的变化主要是由糖解氢释放所推动的。然而，抗霉素 A 和 rotenone 以及 2-脱氧葡萄糖的氧气消耗率的增加表明，精子封顶期间 OXPHOS 的增加取决于糖解活性。

能量源和药理激活剂和抑制剂可以根据实验的目标而变化，最多可以同时测量多达12种不同的条件。该协议可以很容易地适应其他物种，如人类或牛，其中能量代谢的变化在风化期间同样神秘。