Dieses Protokoll kann verwendet werden, um einen extrazellulären Flussanalysator anzuwenden, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Spermienkapitulation zu überwachen. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit zwischen nicht-kapazitierten und kapazitierten Maussperma zu vergleichen. Entfernen Sie am Tag vor dem Test die Sensorpatrone aus einem extrazellulären Flussmittel-Assay-Kit und stellen Sie die Patrone auf den Kopf neben die Gebrauchsplatte.
Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und fügen Sie 200 Mikroliter Wasser in jeden Brunnen der Versorgungsplatte ein, und legen Sie die Sensorpatrone dann wieder in die Versorgungsplatte. Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Als nächstes werden 25 Milliliter extrazellulärer Flussanalysator in ein 50-Milliliter-Konusrohr eingegliedert und in den 37 Grad Celsius-Nicht-Kohlendioxid-Inkubator 37 Grad Celsius eingelassen.
Um ConA-beschichtete Mikroplatten vorzubereiten, lösen Sie 2,5 Milligramm ConA in fünf Milliliter doppeldestilliertem Wasser auf und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jeden Brunnen eines extrazellulären Flussanalysators 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern der ConA-Lösung zu füllen, und lassen Sie dann den Deckel offen, um die Platte über Nacht trocknen zu lassen. Um den Spermienpuffer vorzubereiten, erhitzen Sie 250 Milliliter extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer auf 37 Grad Celsius und stellen Sie den pH auf 7,4. Ersetzen Sie am Tag des Assays das Wasser in jedem Brunnen der Nutzplatte durch 200 Mikroliter XF-Kalibrant pro Brunnen und legen Sie die Platte für mindestens eine Stunde wieder in den Nicht-Kohlendioxid-Inkubator.
Um eine Wellenvorlage zu generieren, aktivieren Sie den extrazellulären Flussanalysator. Während sich die Temperatur auf 37 Grad Celsius stabilisiert, öffnen Sie die Wellensoftware und öffnen Sie eine leere Vorlage. Definieren Sie unter der Registerkarte Gruppendefinitionen das Assaymedium als TYH und den Zelltyp als Maussperma, sodass die Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer bleiben.
Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung, und öffnen Sie die Plattenkarte, um jede Gruppe bestimmten Brunnen zuzuweisen. Fügen Sie unter der Registerkarte Protokoll das Aussetzen von Hervorhebungsergebnissen auf, fügen Sie jeden der vier verschiedenen Messzyklen hinzu, wählen Sie den entsprechenden Port aus, und bearbeiten Sie die Messdetails, sodass die Messgröße nach der Injektion hervorgehoben wird, speichern Sie dann die Assay-Vorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus und speichern Sie die Ergebnisse. Vor der Ernte des Spermas, vorwärmen 50 Milliliter TYH Puffer bei 37 Grad Celsius.
Nach der Ernte von Caudas von erwachsenen männlichen Mäusen, legen Sie jede Cauda in 500 Mikroliter des vorgewärmten TYH-Puffers in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Verwenden Sie Zangen, um jede Cauda einzeln an der Unterseite jedes Brunnens zu immobilisieren und schnell fünf bis sieben kleine Schnitte in jedem Gewebe mit einer Federschere zu machen. Wenn alle Caudas eingeschnitten sind, legen Sie die Platte sofort in den Nicht-Kohlendioxid-Inkubator, damit sich das Sperma 15 Minuten lang dispergieren kann.
Um die Sensorpatrone zu laden, entfernen Sie den Deckel von der Sensorpatrone und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Halten Sie die Anschlussladeführung an Ort und Stelle, legen Sie die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher von Port A und injizieren Sie 20 Mikroliter TYH-Puffer in jede Säule. Für Port B 22 Mikroliter TYH-Puffer in die Spalten eins bis vier, 22 Mikroliter 500 Millimolar 2-Deoxyglucose in die Spalten fünf bis acht und 25 Mikroliter von fünf Mikromolar-Antimycin A-Roton in die Spalten neun bis zwölf.
Für Port C 25 Mikroliter TYH-Puffer in jede Kolonne mit ungeraden Zahlen und 25 Mikroliter von 10 Millimolaren Dibutyryl-zyklischen AMP 500 Mikromolar IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen injizieren, dann legen Sie die Sensorpatrone mit einer Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 bis 15 Minuten. Um die Spermien zuzubereiten, fügen Sie drei Milliliter von drei Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin im TYH-Puffer zu jedem von drei Fünf-Milliliter-Zentifugenröhren hinzu.
Als nächstes bündeln Sie zwei Samenbrunnen in jeweils drei 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren. Nach dem Zählen, verdünnen Sie das Sperma auf ein zwei mal 10 zu den sieben Spermien pro Milliliter Konzentration pro Probe in frischem TYH mit RinderserumAlbumin ergänzt. Sedimentieren Sie das Sperma durch Zentrifugation und setzen Sie die Spermienpellets in einem Milliliter TYH-Puffer wieder auf.
Zentrifugieren Sie das Sperma wieder und entfernen Sie die Überstande, die darauf achten, die Pellets nicht zu stören. Übertragen Sie jede Spermiensuspension in eine der vorbereiteten Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 180 Mikroliter TYH-Puffer in jede Eckbohrung einer ConA-beschichteten Platte ein. Fügen Sie 180 Mikroliter Sperma in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte und zentrifugieren Sie die Platte zweimal drehen die Platte 180 Grad zwischen zentrifugationen, dann legen Sie die Kalibrierplatte mit der Spermienplatte und den Test fortsetzen.
In diesem repräsentativen Experiment wurden Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-Deoxyglucose und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert. Der Pfeil zeigt die Induktion der Kapitulation an. In Gegenwart von Glukose wurde die Kapitulation von einer siebenfachen Erhöhung der extrazellulären Versauerungsrate begleitet, die durch die Blockierung der Glykolyse mit 2-Deoxyglucose gehemmt wird.
Kapazitierte Spermien zeigten eine 20-fache Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs im Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien, die zeigten, dass Maussperma sowohl die Glykolyse als auch die oxidative Phosphorylierung verbessern, um den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation zu unterstützen. Der Anstieg der extrazellulären Versauerungsrate während der Spermienkapitrezitation wird nicht durch die oxidativen Phosphorylierungsinhibitoren Antimycin A und Rotone beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Veränderung dieser Rate hauptsächlich durch die Wasserstofffreisetzung aus der Glykolyse angetrieben wird. Die Erhöhung der Sauerstoffverbrauchsrate wird jedoch durch Antimycin A und Roton sowie durch 2-Deoxyglucose blockiert, was zeigt, dass die Zunahme von OXPHOS während der Spermien-Kapazität von der glykolytischen Aktivität abhängt.
Die Energiequelle und die pharmakologischen Aktivatoren und Inhibitoren können je nach Ziel des Experiments variiert und bis zu 12 verschiedene Bedingungen parallel gemessen werden. Das Protokoll kann leicht an andere Arten wie Mensch oder Rind angepasst werden, wo die Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Kapatitierung ebenso rätselhaft sind.
