يوضح هذا البروتوكول التعبير عن الأجسام المضادة وتنقيتها ومراقبة الوقت الحقيقي لتوزيع الأجسام المضادة في الورم والأنسجة. سوف تساعد الأجسام المضادة فحص مع بروتوكول وصفها تحديد الأجسام المضادة التي لديها محدودة توزيع الأنسجة غير محددة، وإثراء توطين الورم. التقنية الموصوفة سريعة وفعالة من حيث التكلفة.
وهناك تقنيات أخرى، مثل التصوير المقطعي المحوسب أحادي الضوئي والتصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية، باهظة التكلفة وتتطلب أجهزة تعقب مشعة وغيرها من أجهزة التتبع المتطورة. لا تقتصر هذه التقنية على الأجسام المضادة التي تستهدف السرطان. يمكن تطبيقه على أي مرض آخر ، مثل أمراض الرئة أو القلب ، لتحليل توزيع الأجسام المضادة في الجسم.
إظهار الإجراء، سيكون جيريمي غيتسمان، فني بيطري من جامعتي. خلايا CHO الخام في 200 ملليلتر من وسائل الإعلام، في ديلونج، Erlenmeyer حيرت قارورة. الجمع بين خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام الحرة CHO مع 50 ميكروغرام من الحمض النووي استنساخ الثقيلة المتغير، و 75 ميكروغرام الحمض النووي استنساخ ضوء متغير في أنبوب 15 ملليلتر.
ثم، دوامة الأنبوب. اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إضافة 750 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر بوليتيلينمين الأسهم إلى حل الحمض النووي, ودوامة بقوة لمدة 30 ثانية.
اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق إضافية. إضافة الخليط بأكمله إلى خلايا CHO في حين يهز يدويا قارورة. احتضان الخلايا على الفور في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 130 لفة في الدقيقة.
في اليوم التالي، إضافة ملليلترين من 100 X عامل مضاد للتكتل، واثنين من ملليلتر من 100 X المضادة للبكتيريا حل للخلايا. احتضان القارورة في 32 إلى 34 درجة مئوية، مع اهتزاز في 130 دورة في الدقيقة. مواصلة زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 11 يوما, إضافة 10 ملليلتر من تغذية Tryptone N1, واثنين من ملليلتر من 100 X الجلوتامين الملحق في كل يوم الخامس.
عد الخلايا في كل يوم ثالث لضمان أن بقاء الخلية لا تزال فوق 80٪ في اليوم 10 أو 11، حصاد المتوسطة لتنقية الأجسام المضادة عن طريق الطرد المركزي للثقافة في 3000 مرات G، وأربع درجات مئوية لمدة 40 إلى 60 دقيقة. ثم، تصفية وسائل الإعلام واضحة مع مرشح زجاجة ميكرومتر 0.22. لتنقية الأجسام المضادة، توازن البروتين A العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من العازلة ملزمة.
تمرير الوسائط المصفاة من خلال العمود بمعدل تدفق ميليلتر واحد في الدقيقة. ثم غسل العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من المخزن المؤقت الربط. استخدام خمسة ملليلترات من عازلة elution لerute الأجسام المضادة في 500 ميكرولتر الكسور.
وتحييد الحموضة من الأجسام المضادة ألمح بإضافة 10 ميكرولترات من عازلة تحييد للكسر. قياس تركيز الأجسام المضادة النقية مع مقياس الطيف باستخدام البروتوكول الافتراضي لIgG. Dialyze 0.5 ملليلتر من الأجسام المضادة باستخدام كاسيت غسيل الكلى في لتر واحد من العازلة اقتران.
بعد أربع ساعات، قم بنقل كاسيت غسيل الكلى إلى المخزن المؤقت الطازج و دياليزي بين عشية وضحاها. لإعداد تفاعل اقتران، إضافة 0.03 ميكروغرام من صبغة IRR 800 CWU لكل ملليغرام واحد من الأجسام المضادة في حجم إجمالي 500 ميكرولترات. احتضان الخليط لمدة ساعتين في 20 درجة مئوية، ثم تنقية conjugates المسمى عن طريق غسيل الكلى واسعة النطاق ضد برنامج تلفزيوني.
تقدير درجة وضع العلامات عن طريق قياس امتصاص صبغة 780 نانومتر، وامتصاص البروتين في 280 نانومتر. لتطوير الماوس xenographs، ورفع بلطف الجلد من الحيوان وفصله عن طبقة العضلات الكامنة. حقن ببطء 100 ميكرولترات من تعليق الخلية تحت الجلد مع إبرة قياس 26.
انتظر لبضع ثوان قبل أخذ الإبرة بحيث مصفوفة الطابق السفلي المتوسطة إبلاغ شبه صلبة هلام مثل هيكل جنبا إلى جنب مع الخلايا تحت الجلد، والتي سوف تمنع الخليط من الخروج من موقع الحقن. لأداء في التصوير الجسم الحي، حقن الأجسام المضادة المسمى صبغة عبر الوريد الذيل. بعد تخدير الماوس ، تحقق من عدم وجود استجابة لردود الفعل دواسة ، وتمدد الوريد عن طريق تطبيق الماء الدافئ.
استخدم حقنة الأنسولين 1cc مع إبرة قياس 26 لحقن 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة المسماة في حجم 100 ميكرولترات. كتحكم سلبي، تسمية وحقن الأجسام المضادة IgG غير محددة التي لا تستهدف الخلايا السرطانية. أداء في التصوير في الجسم الحي ثماني ساعات، 24 و 48 ساعة بعد حقن الأجسام المضادة.
في برنامج التصوير، انقر فوق تهيئة. تأكد من أن درجة حرارة المرحلة هي 37 درجة مئوية. في لوحة التحكم، قم بإعداد التصوير بالفلور من خلال معالج التصوير، وقم بتعيين الإثارة إلى 773 نانومتر، والانبعاثات إلى 792 نانومتر.
نقل الماوس المُجَدَّد إلى غرفة التصوير. ضعه في مجال التصوير باستخدام مخروط الأنف. عندما تكون جاهزة، انقر فوق الحصول على لوحة التحكم للحصول على الصورة، وانقر فوق عرض تلقائي.
الصورة التي تم إنشاؤها هي تراكب الفلوريسنس على الصورة الفوتوغرافية مع الفلوريسينت البصرية والكثافة المعروضة في وحدات من العد أو الفوتونات. تم تأكيد استنساخ cDNA إيجابية مع مجالات الضوء الثقيل المتغير ومتغير مع مستعمرة PCR. تظهر هنا النتائج التمثيلية لـ farletuzumab المنقى تشغيل على صفحة SDS غير الخفض والحد.
أنتجت السلاسل الثقيلة والخفيفة 50 و 25 كيلودالون بعد تخفيض. كما تم تأكيد ربط الأجسام المضادة بالبروتينات المحلية في سطح الخلية. تم حقن الأجسام المضادة المسماة بفلورسنت بشكل والأجسام المضادة، في الفئران المطعمة بـ R1 الكامل الذي يعبر عن الأورام.
الحيوانات كانت تعيش صورة في نقاط زمنية متعددة باستخدام IVIS. البيانات confirs الإثراء الانتقائي للأجسام المضادة R1 و BaCa الكامل في الأورام. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن صيانة خلايا CHO التي تحتفظ بها أمر بالغ الأهمية بالنسبة لـ العائد من الأجسام المضادة.
ومن المهم أن يكون درجة مماثلة من صبغة الفلورسنت لتدريج الورم التنافسية. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل كيمياء الأنسجة المناعية والأنسجة أو الورم المحدد ELISA لدعم بيانات التصوير للفئران الحية.
