ويستخدم هذا البروتوكول للكشف عن الانصهارات الجينية بالمعلومات الهامة لعينات ورم المريض. يتم تقييم حالة الانصهار لعشرات الجينات في وقت واحد في مقايسة واحدة. وميزة هذه التقنية هي أنه يمكنني تحديد الاندماجات الجينية بغض النظر عن هوية شريك الاندماج من عينات الورم التي تمت معالجتها عن طريق التثبيت صياغة.
الكشف عن بعض الانصهار الجيني في عينة الورم السريرية إعلام التشخيص مباشرة, التشخيص والعلاج اختيار في العديد من أنواع السرطان. من المهم أن نفهم أن العديد من الانصهارات التي تسمى من قبل خوارزمية التحليل هي القطع الأثرية. المهمة الأكثر صعوبة عند تحليل البيانات هو التمييز بين المكالمات الفنية والانصهار الحقيقي.
تبدأ عن طريق تخفيف مجموع الحمض النووي لتحقيق التركيز المطلوب من الجيش الملكي النيبالي. لكل عينة، ونقل 20 ميكرولترات من التخفيف في أنابيب الشريط الكواشف العشوائية في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا من ست إلى ثماني مرات. تدور لفترة وجيزة أسفل العينات، ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى لوحة PCR 96-well، وختم مع فيلم ختم لوحة.
أدخل اللوحة في دراجة حرارة، واغطيها بلوحة الضغط، واغلق الغطاء. احتضان في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، نقل كامل حجم المنتج فتيلة عشوائية في أنابيب الشريط الكاشف الأول.
مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتدور لفترة وجيزة إلى أسفل. نقل وحدة التخزين بأكملها إلى لوحة PCR 96-well وختم مع فيلم RT. أدخل اللوحة في الدراجات الحرارية وادير التفاعل وفقًا لاتجاهات المخطوطة.
قم بأداء توليف cDNA، وإصلاح، وخطوة الربط الأولى وفقًا لاتجاهات المخطوطة، ثم انتقل إلى خطوة الربط الثانية. لترقيم الباركود الجزيئي أو أنابيب شريط محول MBC، ضع الأنابيب أفقيا مع المفصلات إلى الخلف واستخدام علامة دائمة. خذ لوحة تنقية حبة من الخطوة الأولى الربط ونقل 40 ميكرولترات من كل عينة في أنابيب شريط محول MBC، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه حبة.
خلط الكواشف عن طريق الأنابيب، تدور أسفل الأنابيب، ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى ربط الخطوة اثنين أنابيب الشريط الكاشف. اخلط العينات، قم بسدها، وضعها في كتلة ثيرموساير. اترك الغطاء الساخن قبالة وتشغيل الدراجات الحرارية في 22 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، تليها 4 درجات مئوية عقد.
المقبل، وإعداد الخرز تنظيف الربط من خلال دوامة لهم وإضافة 50 ميكرولترات إلى مجموعة جديدة من أنابيب الشريط PCR. احتضان على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة وتجاهل supernatant. إزالة أنابيب قطاع من المغناطيس وإعادة ربط الخرز في 50 ميكروليترس من عازلة تنظيف الربط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
نقل وحدة التخزين عينة كاملة من الخطوة ربط الثاني إلى شريط حبة تنظيف الربط. دوامة العينات لخلط وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. دوامة العينة مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال الحضانة.
بعد ذلك، دوامة العينات، تدور عليهم، واحتضان على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. تجاهل supernatant وإضافة 200 ميكروليترات من العازلة تنظيف الربط الطازجة. دوامة إلى resuspend، تدور أسفل، ووضع على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.
بعد غسل اثنين، وإجراء غسل الثالثة باستخدام الماء فائقة الpure بدلا من العازلة. Resuspend الخرز في 20 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم 5 ملليمترات ونقل العينات إلى لوحة PCR 96 جيدا. ضع اللوحة في دراجة حرارة مع وسادة ضغط واركضها عند درجة 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 4 درجات مئوية.
مرة واحدة قد تبريد العينات إلى 4 درجات مئوية، ووضع لوحة على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق على الأقل والمضي قدما مع PCR الأولى. 12- إعداد تفاعلات PCR بإضافة جهازي ميكرولترات من الزهرات الأولية لنظام الأفضليات المعمم 1 إلى كل بئر من أول شريط كاشف لل PCR. نقل 18 ميكرولترات من المنتج تنظيف الربط الثاني إلى أنابيب الشريط الكاشف PCR الأولى ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
تدور أسفل العينات ونقلها إلى لوحة PCR 96-well. ضعها في الدراجات الحرارية وتشغيل PCR وفقًا لاتجاهات المخطوطة. المضي قدما في تنقية حبة بإضافة 20 ميكرولترات من المنتج PCR إلى لوحة U-أسفل مليئة 24 ميكروليترس من الخرز تنقية في بئر.
الماصات صعودا وهبوطا لخلط وترك لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، ثم احتضان لوحة على المغناطيس لمدة دقيقتين. تجاهل supernantant من الخرز وغسلها مرتين مع 200 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول. بعد الغسيل النهائي، قم بإزالة كل الإيثانول واترك عينة الهواء تجف لمدة دقيقتين.
إزالة لوحة من المغناطيس وإعادة تعليق الخرز في 24 ميكرولترات من 10 ملليمتر تريس-HCl وhH 8.0. احتضان قبالة المغناطيس لمدة ثلاث دقائق ومن ثم وضع لوحة مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقتين. ابدأ كمية المكتبة عن طريق إعداد واحد إلى خمسة من التخفيفات من المنتج PCR الثاني في 10 ملليمتر تريس-HCl.
اتبع هذا من قبل تخفيف المسلسل من 1:199، 1:199، و 20:80 في 10 ملليمتر تريس-HCl مع 05٪ بوليسوربات. إعداد PCR الرئيسية عن طريق إضافة ستة ميكرولترات من مزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة بصرية 96-جيدا، تليها أربعة ميكرولترات من التخفيف المناسبة أو المعيار. تدور أسفل لوحة وتحميلها في صك qPCR.
تنفيذ qPCR وفقا لاتجاهات المخطوطة. بعد اكتمال كم المكتبة، تمييع جميع المكتبات إلى اثنين نانوموللار مع 10 ملليمتر تريس-HCl. جعل تجمع مكتبة من خلال الجمع بين 10 ميكرولترات من كل مكتبة تطبيع في أنبوب واحد microcentrifuge 1.5 ملليلتر.
بعد ذلك ، قم بإعداد مكتبة أمليكون المشوهة ، أو بركة DAL ، من خلال الجمع بين 10 ميكرولترات من بركة المكتبة مع 10 ميكرولترات من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم العادي واحتضان الخليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، إضافة 10 ميكرولترات من 200 ملليمتر تريس-HCl في 7.0 pH، تليها 970 ميكرولترات من HT1 التهجين العازلة. جعل أنبوب التحميل النهائي من خلال الجمع بين 300 ميكرولترات من HT1، 25 ميكرولتر من 20 PhiX picomolar، و 675 ميكرولترات من بركة DAL.
إضافة وحدة التخزين بالكامل من أنبوب التحميل إلى العينة جيدا من خرطوشة كاشف التسلسل وتحميل خرطوشة في إلى المنظم. ابدأ باختيار عينة التحكم الإيجابية وتأكد من أن جميع عمليات الإنصهار المتوقعة والأيزوفورمات المُعَدَّة قد تم اكتشافها ويتم سردها في علامة التبويب الأدلة القوية. لكل عينة، تفقد متوسط مواقع البداية الفريدة لكل قيمة تحكم GSP2، ثم تصور القراءة الداعمة لكل اندماج محتمل من خلال النقر فوق ارتباط تصور يأخذ المستخدم إلى طريقة عرض JBrowse المستندة إلى الويب من عمليات تجميع عمليات الانصهار الفردية الداعمة.
تأكد من أن معظم القراءات خالية من عدم التطابق، ولكن أكثر من 30 قاعدة من القراءات تتماشى مع شريك الاندماج، وأن التسلسلات المجاورة لنقطة التوقف بين الجينات ومواقع الربط التمهيدي خالية من عمليات الإدراج أو الحذف. من الضروري التأكد من أن كل الانصهار المكالمة بشكل عام خالية من عدم التوافق وأن جزء كبير من القراءة محاذاة إلى شريك الانصهار. وقد استخدم هذا البروتوكول للتحقيق في حالة الانصهار الجيني في عينة غدية الرئة.
يُظهر الملخص دمج الأدلة القوية وتظهر صفحة "إحصاءات القراءة" مقاييس العينة. هذه العينة معارض جيدة RNA نوعية ذلك النتائج السلبية سيتم الإبلاغ إذا لم يتم العثور على الاندماجات. تحتوي مكالمة الاندماج الشرعية على عدد كبير من القراءات الداعمة، ونسبة عالية من القراءات من التمهيدي الذي يدعم الانصهار، وعدد كبير من مواقع البدء.
التصور من يقرأ يوضح محاذاة جيدة إلى مناطق كبيرة من شريك الانصهار. وعلى العكس، فإن مكالمة الانصهار artifactual لديها مقاييس دعم أقل ومعدل خطأ مرتفع عند التعيين إلى الشريك. المكالمات الانصهار artifactual التي أدلى بها خوارزمية التحليل شائعة.
من المهم فحص كل مكالمة يدويًا للتأكد من أنها تمثل اندماجًا جينيًا حقيقيًا في عينة المريض.
