Этот протокол используется для обнаружения критически информативных синтезов генов для образцов опухоли пациента. Состояние синтеза десятков генов оценивается одновременно в одном анализе. Преимущество этого метода заключается в том, что я могу определить синтез генов независимо от личности партнера по синтезу из образцов опухоли, которые были обработаны с помощью шаблонной фиксации.
Обнаружение определенного синтеза генов в клиническом образце опухоли непосредственно информирует диагностику, прогноз и отбор лечения во многих типах рака. Очень важно понимать, что многие слияния, называемые алгоритмом анализа, являются артефактами. Самой сложной задачей при анализе данных является различие между артефактами и реальными вызовами синтеза.
Начните с разбавления общей нуклеиновой кислоты для достижения желаемой концентрации РНК. Для каждого образца, передача 20 микролитров разбавления в случайных грунтовки реагентов полосы труб в предварительно охлажденный алюминиевый блок и перемешать путем трубопроводов вверх и вниз шесть-восемь раз. Кратко спина вниз образцов, передать весь объем 96-хорошо ПЦР пластины, и печать с пластиной герметику пленки.
Вставьте пластину в термоциклер, накройте компрессионной площадкой и закройте крышку. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут. После инкубации перенесите весь объем случайного грунтовки продукта в первые трубы полоски реагентов.
Смешайте по трубе вверх и вниз и кратко спина вниз. Перенесите весь том на 96-хорошо ПЦР пластины и печать с RT пленки. Вставьте пластину в термоциклер и запустите реакцию в соответствии с рукописными указаниями.
Выполните синтез второй нити кДНК, и ремонт, и лигация шаг один в соответствии с рукописными направлениями и перейти ко второму шагу перевязки. Чтобы про номер молекулярного штрих-кода или MBC адаптер полосы труб, положение труб горизонтально с петлями к спине и использовать постоянный маркер. Возьмите пластину очистки бисера с первого шага перевязки и перенесите 40 микролитров каждого образца в трубки полосы адаптера MBC, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы шарика.
Смешайте реагенты путем трубопроводов, спина вниз трубы, и передать весь объем перевязки шаг два реагента полосы труб. Смешайте образцы, спина их вниз, и место в термоциклер блока. Оставьте нагретую крышку и запустите термоциклер при 22 градусах по Цельсию в течение пяти минут, а затем 4 градуса по Цельсию провести.
Далее, подготовить перевязку очистки бисера, вихревые их и добавить 50 микролитров в новый набор ПЦР полосы труб. Инкубировать на магните в течение одной минуты и отказаться от супернатанта. Удалите полоску трубки из магнита и повторно бусинки в 50 микролитров лигации очистки буфера путем трубопроводов вверх и вниз.
Перенесите весь объем выборки со второго шага перевязки в полосу шарика очистки перевязки. Вихрь образцы смешать и оставить их при комнатной температуре в течение 10 минут. Вихрь образца один раз на полпути через инкубацию.
После этого вихрь образцов, спина их вниз, и инкубировать на магните в течение одной минуты. Откажитесь от супернатанта и добавьте 200 микролитров свежего буфера очистки перевязки. Вихрь, чтобы повторно, спина вниз, и место на магните в течение одной минуты.
После двух моет, выполнить третью стирку с использованием ультрачистой воды вместо буфера. Перепродюсните бисер в 20 микролитров 5 миллиметров гидроксида натрия и перенесите образцы на 96-хорошую ПЦР-пластину. Поместите пластину в термоциклер с компрессионной площадкой и запустите ее при 75 градусах по Цельсию в течение 10 минут, а затем 4 градуса по Цельсию провести.
После того, как образцы остыли до 4 градусов по Цельсию, поместите пластину на магнит, по крайней мере три минуты и приступить к первому ПЦР. Подготовьте реакции ПЦР, добавив два микролитров грунтовки GSP1 к каждому колодецу первой полосы реагентов ПЦР. Передача 18 микролитров второго продукта очистки перевязки на первый ПЦР реагент полосы труб и перемешать путем трубопроводов вверх и вниз.
Спин вниз образцов и передать их в 96-хорошо ПЦР пластины. Поместите их в термоциклер и запустите ПЦР в соответствии с рукописными указаниями. Продолжить очистку бисера, добавив 20 микролитров продукта ПЦР на U-нижней пластины заполнены 24 микролитров очищения бисера на колодец.
Pipette вверх и вниз, чтобы смешать и оставить пластину при комнатной температуре в течение пяти минут, а затем инкубировать пластину на магните в течение двух минут. Откажитесь от супернанта из бисера и мыть их дважды с 200 микролитров 70% этанола. После окончательной стирки удалите весь этанол и дайте образцу высохнуть в течение двух минут.
Снимите пластину с магнита и повторно наполните шарики в 24 микролитерах 10 миллиметров Tris-HCl и pH 8.0. Инкубировать магнит в течение трех минут, а затем поместить пластину обратно на магнит в течение двух минут. Начните библиотечную количественную оценку, подготовив от одного до пяти разбавления второго продукта ПЦР в 10-миллиметровом Tris-HCl.
Следуйте этому серийное разбавление 1:199, 1:199, и 20:80 в 10 миллиметров Tris-HCl с 05%полисорбатом. Настройка ключевых ПЦР путем добавления шести микролитров мастер-микса к каждой скважине оптической пластины 96 скважин, а затем четыре микролитров соответствующего разбавления или стандарта. Закрутите пластину и загрузите ее в прибор qPCR.
Выполните qPCR в соответствии с рукописными указаниями. После завершения количественной оценки библиотеки разбавляют все библиотеки двумя наномолярами с 10-миллиметровым Tris-HCl. Сделайте библиотечный пул, объединив 10 микролитров каждой нормализованной библиотеки в одну микроцентрифугную трубку на 1,5 миллилитров.
Затем подготовьте денатурированную библиотеку ампликона, или бассейн DAL, объединив 10 микролитров библиотечного бассейна с 10 микролитров 0,2 нормального гидроксида натрия и инкубации смеси в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации добавьте 10 микролитров 200-миллиметровых Tris-HCl при рН 7.0, а затем 970 микролитров буфера гибридизации HT1. Сделайте окончательную трубку нагрузки, объединив 300 микролитров HT1, 25 микролитров 20 пикомолярных PhiX и 675 микролитров пула DAL.
Добавьте весь объем трубки нагрузки к образцу хорошо секвенсор реагент картриджа и загрузить картридж в секвенсор. Начните с выбора положительного образца управления и убедитесь, что все ожидаемые слияния и онкогенные изоформы были обнаружены и перечислены в вкладке убедительных доказательств. Для каждого образца проинспектировать средние уникальные стартовые сайты на значение управления GSP2, а затем визуализировать вспомогательные считывает для каждого потенциального слияния, нажав на ссылку Visualize, которая принимает пользователя на веб-JBrowse зрения pileups отдельных синтеза поддержки читает.
Подтвердите, что считывания в основном свободны от несоответствия, но более 30 оснований считывания выравниваются с партнером по синтезу, и что последовательности, прилегающие к точке разрыва между генами и сайтами связывания грунтовки, свободны от вставок или удалений. Крайне важно обеспечить, чтобы каждый вызов слияния, как правило, свободны от неровности и что значительная часть читает выровнять с партнером слияния. Этот протокол был использован для исследования статуса синтеза генов в образце аденокарциномы легких.
Резюме показывает убедительные доказательства слияния и читать Статистика страница показывает метрики выборки. Этот образец показывает хорошее качество РНК, поэтому отрицательные результаты будут сообщены, если не слияния не были найдены. Законный вызов синтеза имеет большое количество поддерживающих считывает, высокий процент читает от грунтовка поддержки слияния, и большое количество стартовых площадок.
Визуализация считывания демонстрирует хорошее соответствие крупным регионам партнера по синтезу. И наоборот, вызов артефактного синтеза имеет более низкие поддерживающие метрики и высокую скорость ошибок при отображении партнеру. Артефактные вызовы синтеза, сделанные алгоритмом анализа, являются обычным явлением.
Очень важно вручную проверить каждый звонок, чтобы убедиться, что он представляет собой реальное слияние генов в образце пациента.
