استقرار التخزين من السعايا الخلوية الإضافية هو معلمة هامة لاستخدامها العلاجي المحتمل. يوفر بروتوكولنا أداة قابلة للتطبيق بسهولة لتقييم كيفية تأثير التخزين على الـ(vesicles). الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنه من خلال إدخال glucuronidase كعلامة خارجية ، vesicles خارج الخلية المستمدة من الخلايا الأم المختلفة يمكن مقارنة بسهولة فيما يتعلق بصلاحيتها.
تجزئة تدفق تدفق تدفق غير متماثل، أو AF4، هو بديل معتدل لحجم تنقية الكروماتوغرافيا استبعاد للمركبات الحساسة جدا. لأن المركبات تواجه أقل محض الإجهاد في القناة. كما glucuronidase هو انزيم حساس, نوعية يقيم فوائد من التخطيط الدقيق وتنفيذ خطوات لتنقية وتحليل العودة إلى الوراء.
بعد زراعة خط الخلية من الفائدة وفقا للشروط القياسية لتلك الخلايا، استبدال مغامر مع المصل الحر أو اضافية حويصلات الخلوية المنضب المتوسطة والعودة إلى الخلايا الحاضنة ثقافة الخلية لمدة إضافية 24 إلى 72 ساعة. في نهاية الحضانة، وجمع نات السوبر من كل قارورة والطرد المركزي العينات إلى رواسب الخلايا. جمع بعناية في المتوسطة الخلية مشروطة دون إزعاج بيليه.
وطاردة مركزية المتوسطة مرة أخرى لإزالة حطام الخلية والمجاميع الكبيرة. ثم نقل بعناية supernatants في أنابيب فائقة التركيز. إذا كان استخدام دوار زاوية ثابتة، وضع علامة على اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لتسهيل استرجاع بيليه من خارج الخلية بعد الطرد المركزي.
في نهاية الطرد الفائق، استخدم ماصة مصلية لتجاهل المابس بعناية دون إزعاج بيليه الحويصلة خارج الخلية. في 200 ميكرولترات من 0.2 ميكرومتر المسام تصفية برنامج تلفزيوني إلى السوبر المتبقية من أنبوب فائقة الوضوح الأول. بعد resuspending بيليه، نقل تعليق vesicle خارج الخلية الناتجة إلى الأنبوب التالي لإعادة النيطة اللاحقة حتى تم إعادة تعليق جميع الكريات من خارج الخلية.
إضافة بيتا glucuronidase إلى الحل بيليه resuspended النهائي لتركيز النهائي من 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر. والسابونين إلى تركيز نهائي من 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. ثم تخلط جيدا من خلال دوامة لمدة ثلاث ثوان ووضع رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع الخفقان لطيف متقطعة.
بمجرد أن تم تغليف glucuronidase، تأكد من تنفيذ جميع خطوات تقييم حابية تنقية اللاحقة في نفس اليوم للحصول على نتائج استقرار التخزين غير متحيزة. يكون حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا توازنها مع ما لا يقل عن اثنين من وحدات التخزين العمود من برنامج تلفزيوني على استعداد لتنقية بيليه مباشرة بعد حضانة saponin. لتنقية، إضافة ما يصل إلى 400 ميكرولترات من تعليق خارج الخلية إلى العمود.
ثم جمع كسور ملليلتر واحدة من الويّز. لتتوافق مع فصل من حويصلات خارج الخلية من البروتينات الملوثة وخالية من الجلوكورونيداز، وقياس تركيز البروتين من قبل مقايسة حمض bicinchoninic وفقا لتعليمات المصنعين. باستخدام المعلمات الأمثل لأداة كل ونوع من نوع الفينة، واستخدام أداة تحليل تتبع الجسيمات نانو لقياس حجم الخلايا خارج الخلية والتركيز.
لقياس نشاط جلوكرونيديز، إضافة 25 ميكرولترات من الفلوريسين الطازجة إعداد دي-بيتا-D-glucuronide إلى 125 ميكرولترات من الفهيصلات خارج الخلية المنقاة وإضافة العينة إلى بئر واحد من لوحة سوداء 96 جيدا. قياس إنتاج الفلوريسين الصفر الوقت على قارئ لوحة في 480 نانومتر الإثارة و 516 نانومتر الانبعاثات. غطي اللوحة بإحكام مع رقائق بلاستيكية شفافة للحد من التبخر.
ثم احتضان لوحة محمية من الضوء لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية. قياس إنتاج الفلوريسين 18 ساعة على قارئ لوحة كما أظهرت للتو. بالنسبة للتجميل خارج الخلية، أضف أربعة ملليجرامات لكل ملليلتر من الترهالوس إلى الفينات المنقى.
وتجميد الحويصلات في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. لlyophilize العينات، تعيين درجة حرارة الرف من مزيل ال التسليح إلى 15 درجة مئوية والضغط إلى 0.180 ملليبار. جففي الـ"هاد" في ظل هذه الظروف لمدة 46 ساعة.
في نهاية خطوة التجفيف الرئيسية، تعيين درجة حرارة الرف إلى 25 درجة مئوية والضغط إلى 0035 ملليبار وتجفيف العينات لمدة ساعتين في ظل هذه الظروف. ثم تخزين العينات الميوفية في أربع درجات مئوية. لإعادة تهويد العينات بعد التخزين، إضافة كمية من الماء يساوي حجم تعليق الفضوي خارج الخلية قبل الليسفيلي.
لتقييم نشاط الإنزيم بعد التخزين، قم بتحميل أداة AF4 مع 0.1 ميكرومتر مرشّح حديثًا من برنامج PBS للمرحلة المتنقلة وأدخل غشاء فلتر ميكرومتر 0.1 في مرشح مدخل الذروة بعد المضخة لتقليل ضوضاء الجسيمات من المذيبات. بعد تفكيك، تنظيف قناة صغيرة لAF4 مع المياه millEq. هيدرات غشاء السليلوز جديدة مجددة مع قطع الوزن الجزيئي من 30 كيلودالون ووضع الغشاء على رأس الحنق مع الجانب لامعة حتى.
ضع مسافة 350 ميكرومتر واسعة تحت النصف العلوي من القناة وتجميع أجزاء القناة. باستخدام مفك عزم الدوران، وتشديد مسامير أولا إلى عزم دوران خمسة متر نيوتن، ثم إلى عزم دوران من سبعة متر نيوتن. تشديد المسامير حول الكتلة في نمط متقاطع.
قم بتوصيل مدخل القنوات والمنفذ ومنفذ التدفق عبري إلى الكسوف. ثم من ثلاث عينات قديمة على الأقل لتكبيل الغشاء. برنامج تشغيل تجزئة مع تدفق كاشف وتدفق التركيز تعيين إلى ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة وتدفق حقن من 0.2 ملليلتر في الدقيقة.
بعد خطوة قبل التركيز لمدة دقيقة واحدة، حقن العينة على مدى فترة 10 دقائق في التركيز والحقن خطوة، قبل تقليل تدفق عبر من ملليلتر اثنين في الدقيقة إلى 0.1 ملليلتر في الدقيقة على مدى ثماني دقائق. الانتهاء من تشغيل تجزئة مع خطوة elution دون تدفق عبر لمدة 10 دقائق وإضافة خطوة الغسيل من elution والحقن، تليها elution. ثم اضبط القناة للشوط التالي مع تدفق عبر أولي من ميليلترين في الدقيقة الواحدة وتعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية إلى 280 نانومتر.
عندما تم تعيين جميع البرامج ، وحقن 300 ميكرولترات من العينة وتسجيل الأشعة فوق البنفسجية وإشارات تشتت الضوء في برنامج ASTRA. بعد 12 دقيقة ونصف, تبدأ في جمع كسور ملليلتر واحد حتى 27 دقيقة حقن آخر. ثم تنفيذ مقايسة جلوكرونيديز وتحليل تتبع الجسيمات نانو كما ثبت.
هنا، يظهر استرداد الجسيمات وحجم الحويصلات خارج الخلية المعزولة من الخلايا البطانية الوعائية البشرية بعد سبعة أيام من التخزين في ظروف مختلفة بالمقارنة مع عينة جديدة. وخضعت الزعويات بعد ذلك لتنقية AF4 وتم قياس نشاط الجلوكورونيدز لكل جسيم. كلا الكروماتوغرافيا استبعاد حجم و AF4 ناجحة في فصل حويظة خارج الخلية من جلوكورونيديز الحرة.
بسبب درجة أعلى من الفصل ل AF4 بين الجسيمات والانزيم الحر، تلوث الكسور التي تحتوي على حويصلات أقل احتمالا. AF4 تنقية بعد التخزين يزيل إنزيم الحرة من العينات، وبالتالي يقلل من كمية نشاط الانزيم المستردة لكل جسيم. هذا التأثير هو الأكثر بروزا بعد التخزين في أربع درجات مئوية، والتي لوحظت 2/3 تخفيض.
حذف هذه الخطوة تنقية إضافية يمكن أن يؤدي إلى افتراض خاطئ حول استقرار الانزيم. لا يكشف المجهر الإلكتروني انتقال اختلافات كبيرة في الشكل للحويصلات خارج الخلية lyophilized دون cryoprotectant. المسح المجهري الإلكتروني التصوير، ومع ذلك، يكشف عن وجود مجاميع داخل العينات الlyophilized التي لم يتم العثور عليها في العينات المخزنة ناقص 80 درجة.
ومن الأهمية بمكان أن يتم إزالة إنزيم الحرة من حويصلات قبل مقايسة جلوكرونيديز. وبالتالي، فإن التقنية المستخدمة لتنقية الفُضاءة تحتاج إلى تقييم دقيق. ويمكن أيضا أن ينظر إلى الجسيمات النقية من حيث شحن سطحها لمعرفة ما إذا كان التخزين قد غير التكوين الطبيعي للبروتينات الغشاء أو السكريات.
مع أسلوبنا، فمن الممكن الحصول على أول إشارة حول استقرار تخزين الخلايا خارج الخلية، حتى عندما لا توجد علامات محددة معروفة أو المقايسات للنشاط المتاحة.
