في الفيديو ، نقدم بروتوكولا لتكسير تجميد الحويصلات خارج الخلية الناشئة عن خلايا سرطان المثانة في المختبر. الحويصلات خارج الخلية هي حويصلات محدودة الغشاء مشتقة من الخلايا يتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية ولها دور في التواصل بين الخلايا. داخل الحويصلات خارج الخلية ، نميز ثلاث مجموعات سكانية ، exosomes ، microvesicles ، والأجسام الماصة ، والتي تختلف حسب أصلها وحجمها وتكوينها الجزيئي.
يعكس التركيب الجزيئي للحويصلات خارج الخلية المظهر الجزيئي للخلية المانحة ويتداخل مع العمليات البيولوجية في الخلية المتلقية. ومع ذلك ، فإن تكوين الغشاء المحدد للحويصلات الخلوية أمر بالغ الأهمية للتفاعل مع غشاء الخلية المتلقية. لتحليل تنظيم الغشاء المحدد ، يجب عزل الحويصلات خارج الخلية أولا ، ثم الاقتراب من تقنية كسر التجميد.
كسر التجميد هو تقنية مجهرية إلكترونية مخصصة لدراسة التنظيم ثنائي الأبعاد للأغشية البيولوجية ، بما في ذلك الحويصلات. خطوات تكسير التجميد هي التجميد السريع للعينة ، وتكسير العينة ، وصنع نسخة طبق الأصل من السطح المكسور المتجمد ، وتنظيف النسخة المتماثلة لإزالة المواد البيولوجية. يتم تصور النسخ المتماثلة أخيرا باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل.
كان هدفنا هو استخدام تقنية كسر التجميد لتوصيف الحويصلات الدقيقة من حيث الشكل والحجم وتكوين الغشاء. ابدأ بالخلايا المتنامية في حاضنة الخلايا. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من تقلبها والتقائها.
جمع وسائط الاستزراع مع الحويصلات الدقيقة في أنابيب ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 غرام قوى لمدة 10 دقائق. جمع supernatant. في وقت لاحق ، الطرد المركزي الفائق في 2000 g-forces و 10،000 g-forces.
بعد ذلك ، راقب طرف الأنبوب للحصول على حبيبة بيضاء تشير إلى الحويصلات الدقيقة. قم بإزالة السوبرناتانت بعناية. أضف 1.5 ملليلتر من PBS ، وأعد تعليق الكريات التي تحتوي على حويصلات دقيقة.
ثم جهاز الطرد المركزي في 10،000 ز القوات. راقب الكريات البيضاء. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأضف المثبت برفق.
اتركيه لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت ، وأضف مخزن الغسيل المؤقت لشطف الكريات دون إعادة تعليقها. اتركيه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
قم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت ، وأضف 30٪ من الجلسرين إلى الكريات. أعد تعليق الكريات إلى تعليق متجانس ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إعداد ناقلات النحاس نظيفة مع حفرة مركزية وتطوير قارورة مع عبوس والنيتروجين السائل.
تحت المجهر ، انقل العينة إلى الحفرة المركزية لحامل النحاس. امزج الفريون المتصلب ليصبح سائلا. أمسك بالحلقة الخارجية للحامل باستخدام ملاقط واغمرها في الفريون المبرد.
بعد ثماني ثوان نقل الناقل بسرعة إلى تطوير قارورة مع النيتروجين السائل. مارك البرد الخسيس وتبريده. تحت النيتروجين السائل جمع الناقلات في حقير ، وإغلاقه ، وتخزينها في حاوية النيتروجين السائل حتى تجميد الكسر.
قم بإعداد وحدة كسر التجميد وفقا لتعليمات التشغيل الخاصة بالشركات المصنعة. ابدأ تشغيل نظام التفريغ وقم بتبريد غرفة الوحدة إلى 150 درجة مئوية تحت الصفر. نقل ناقلات النحاس مع عينة مجمدة إلى وحدة تجزئة التجميد.
اضبط درجة حرارة السكين على 100 درجة مئوية تحت الصفر وانتظر الفراغ. ابدأ في تقسيم العينة عن طريق تشغيل الحركة الآلية للسكين حتى يصبح سطح العينة أملسا. للتكسير ، قم بإيقاف تشغيل الحركة الآلية للسكين والمضي قدما في التحكم اليدوي البطيء في السكين.
تابع التظليل البلاتيني بزاوية 45 درجة. قم بتشغيل التوتر العالي وزيادة التيار إلى البندقية البلاتينية. يجب أن تبدأ شرارات البلاتين في تظليل العينة.
الإشراف على وضع البلاتين على شاشة سمك بلورة الكوارتز. سمك البلاتين الموصى به هو 2.5 نانومتر. قم بإيقاف تشغيل التوتر الحالي والعالي.
تابع تظليل الكربون بزاوية 90 درجة. قم بتشغيل التوتر العالي وزيادة التيار إلى مسدس الكربون. يجب أن تبدأ شرارات الكربون في تظليل العينة.
عندما يتم الحصول على 2.5 نانومتر من الكربون ، قم بإيقاف تشغيل التيار والتوتر العالي. انقل تلك العينات مع النسخ المتماثلة من وحدة كسر التجميد إلى صفيحة مكونة من 12 صماما مملوءة بالماء المقطر المزدوج. سوف تطفو النسخ المتماثلة على سطح الماء بينما تغرق الناقلات.
انقل النسخ المتماثلة ذات الحلقة السلكية إلى صفيحة مكونة من 12 صماما مملوءة بهيبوكلوريت الصوديوم واحتضنها بين عشية وضحاها. اغسل النسخ المتماثلة في ماء مقطر مزدوج. اجمعها على شبكة TM النحاسية واتركها تجف على الهواء لمدة ساعتين.
استخدم المجهر الإلكتروني الناقل لتصوير النسخ المتماثلة والحصول على الصور المجهرية. للحصول على تفسير دقيق للنسخ المتماثلة والرسوم البيانية المجهرية، اتبع الإرشادات الخاصة بالتوجه الصحيح بشأن التسميات. أظهرت تحليلات النسخ المتماثلة أن الوسط المشروط المعزول يحتوي على جزء مخصب من الحويصلات.
تم جمع الحويصلات المعزولة إما في مجموعات من ثلاثة أو أكثر أو تم توزيعها بشكل فردي للغاية. كانت الحويصلات كروية الشكل. قطر الحويصلات يتوافق مع قطر الحويصلات الدقيقة.
كشف تكسير التجميد أيضا عن تنظيم ثنائي الأبعاد لغشاء الحويصلات الدقيقة. كان للمرحلة الخارجية للحويصلات الدقيقة مظهر سلس وموحد بينما لاحظنا في مرحلة البروتوبلاست جسيمات بين الأغشية. ظهرت الجسيمات بين الأغشية بشكل متقطع ، مما يعني أن الحويصلات الدقيقة المعزولة من خلايا المواد السرطانية تحتوي فقط على كمية منخفضة من بروتينات الغشاء أو تجمعات البروتين.
وخلاصة القول إن تقنية كسر التجميد المستخدمة في البروتوكول المقدم تثبت أنها التقنية المثلى لتوصيف الحويصلات خارج الخلية ويمكن استخدامها لتقييم مجموعات أخرى من الحويصلات خارج الخلية. ميزة حاسمة لتقنية كسر التجميد هي قدرتها على حل التنظيم الداخلي للغشاء الذي يحد من الحويصلات ، والذي يحدد الوظيفة البيولوجية للحويصلات خارج الخلية.
