細胞外小胞の貯蔵安定性は、その前向きの治療的使用のための重要なパラメータである。当社のプロトコルは、ストレージが小胞に与える影響を評価するための容易に適用可能なツールを提供します。我々の技術の主な利点は、外因性マーカーとしてグルクロニダーゼを導入することにより、異なる親細胞に由来する細胞外小胞がそれらの安定性に関して容易に比較されることである。
非対称流量流分画(AF4)は、非常に感受性の高い化合物に対するサイズ排除クロマトグラフィー精製に対する軽度の代替物である。化合物は、チャネルで少ない純粋なストレスに遭遇するため.グルクロニダーゼは敏感な酵素であるため、居住する品質は、徹底的な計画を立て、精製と分析のステップを繰り返し実行することから利益を得ます。
これらの細胞の標準的な条件に従って目的の細胞株を培養した後、上清を無血清または余分な細胞小胞枯渇培地に置き換え、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに24〜72時間戻します。インキュベーションの終わりに、各フラスコからスーパーナタンを回収し、サンプルを遠心分離して細胞を沈降させる。ペレットを邪魔することなく、細胞調整培地を慎重に収集します。
そして、再び遠心分離機を使用して、細胞の破片および大きな凝集物を除去する。その後、慎重に超遠心チューブに上清を転送します。固定角度ローターを使用する場合は、遠心分離機のチューブの向きをマークして、遠心分離後の細胞外小胞ペレットの検索を容易にします。
超遠心分離の終わりに、細胞外小胞ペレットを乱すことなく慎重に上清を廃棄するために血清ピペットを使用してください。0.2マイクロメートルの200マイクロリットルで、第1の超遠心管の残留上清にPBSを濾過した。ペレットを再懸濁した後、得られた細胞外小胞懸濁液を次のチューブに移し、その後のペレットの再懸濁液を、全ての細胞外小胞ペレットが再懸濁されるまで行う。
最終再懸濁ペレット溶液にβグルクロニダーゼを加え、1ミリリットル当たり1.5ミリグラムの最終濃度にします。そしてサポニンは1ミリリットル当たり0.1ミリグラムの最終濃度に。その後、3秒間ボルテックスでよく混ぜ、断続的に穏やかなフリックで10分間室温で反応を置きます。
グルクロニダーゼが封入されたら、その後の精製ベシクル評価ステップをすべて同じ日に実行し、不偏な貯蔵安定性の結果を得るようにしてください。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、サポニンインキュベーションの直後にペレットを精製する準備ができてPBSの少なくとも2つのカラム容量と平衡化した。精製するには、最大400マイクロリットルの細胞外小胞懸濁液をカラムに加えます。
その後、溶出物の1ミリリットル分を収集します。汚染タンパク質と遊離グルクロニダーゼからの細胞外小胞の分離を適合させるために、製造業者の指示に従ってビチンチオン酸アッセイによってタンパク質濃度を測定する。それぞれの装置と小胞の種類に最適化されたパラメータを使用して、ナノ粒子追跡分析装置を使用して細胞外小胞のサイズと濃度を測定します。
グルクロニダーゼ活性を測定するには、精製された細胞外小胞の125マイクロリットルに作りたての蛍光を25マイクロリットルの蛍光体から25マイクロリットル加え、黒い96ウェルプレートの1つのウェルにサンプルを加えます。480ナノメートルの励起および516ナノメートルの放射で版の読者の時間ゼロの蛍光の生産を測定する。蒸発を減らすために透明なプラスチック箔でプレートをしっかりと覆います。
その後、光から保護されたプレートを摂氏37度で18時間インキュベートします。実演したように、プレートリーダー上の18時間の蛍光量を測定します。細胞外小胞凍結乾燥のために、精製された小胞にトレハロース1ミリリットル当たり4ミリグラムを加える。
そして、少なくとも1時間マイナス80度で小胞を凍結します。サンプルを凍結乾燥するには、凍結乾燥機の貯蔵温度を摂氏15度に、圧力を0.180ミリバールに設定します。これらの条件下で小胞を46時間乾燥させます。
主乾燥工程の終わりに、棚温度を摂氏25度、圧力を0035ミリバールに設定し、これらの条件下でサンプルを2時間乾燥させます。その後、凍結乾燥したサンプルを摂氏4度で保存します。保存後にサンプルを水分補給するには、凍結乾燥前の細胞外小胞懸濁液の体積に等しい水量を加える。
貯蔵後の酵素活性を評価するには、AF4機器に、可動相用に新たに調製した0.1マイクロメートルの濾過PBSをロードし、ポンプ後のピーク入口フィルターに0.1マイクロメートルのフィルター膜を挿入して、溶媒からの粒子騒音を低減します。分解した後、millEq水でAF4の小さなチャネルをきれいにしてください。30キロダルトンの分子量を遮断して新しい再生セルロース膜を水和し、光沢のある側面を上にしてフレットの上に膜を置きます。
チャネルの上半分の下に広い350マイクロメートルスペーサーを配置し、チャネル部品を組み立てます。トルクドライバーを使用して、最初にネジを5ニュートンメートルのトルクに締め、次に7ニュートンメートルのトルクに締めます。十字架パターンでブロックの周りのネジを締めます。
チャネルの入口、出口、およびクロスフローポートを日食に接続します。次に、少なくとも3つの古いサンプルから膜を平衡化する。検出器の流れとフォーカスフローを毎分1ミリリットルに設定し、1分あたり0.2ミリリットルの注入フローを使用して分画を実行するようにプログラムします。
1分間の事前フォーカスステップの後、焦点で10分間にわたってサンプルを注入し、ステップを注入してから、8分間にわたって1分間に2ミリリットルから毎分0.1ミリリットルにクロスフローを減少させます。10分間クロスフローのない溶出ステップで分画実行を終了し、溶出と注入の洗浄ステップを追加し、溶出を続けます。次に、1 分間に 2 ミリリットルの初期のクロス フローで次の実行のチャネルを平衡化し、UV 検出器を 280 ナノメートルに設定します。
すべてのプログラムが設定されたら、サンプルの300マイクロリットルを注入し、ASTRAソフトウェアでUVおよび光散乱信号を記録します。12分半後、注射後27分まで1ミリリットル分の採取を開始する。次に、グルクロニダーゼアッセイとナノ粒子追跡分析を実証したとおりに実行します。
ここで、粒子回収と、異なる条件下での7日間の保存後にヒト血管内皮細胞から分離された細胞外小胞のサイズとが、新鮮なサンプルと比較して示されている。ベシクルは、その後AF4精製を行い、粒子当たりのグルクロニダーゼ活性を測定した。サイズ排除クロマトグラフィーとAF4はいずれも、遊離グルクロニダーゼから細胞外小胞を分離することに成功している。
粒子と遊離酵素との間のAF4の分離度が高いため、小胞を含む分画の汚染は少ない。保存後のAF4精製は、サンプルから遊離酵素を除去し、粒子あたりの回収酵素活性を低下させます。この効果は摂氏4度で貯蔵した後に最も顕著であり、2/3の減少が観察される。
この追加の精製ステップを省略すると、酵素安定性に関する誤った仮定につながる可能性があります。透過型電子顕微鏡は、凍結保護剤なしで凍結乾燥した細胞外小胞の形状に大きな違いは明らかにされていない。しかし、走査型電子顕微鏡イメージングは、保存されたサンプルのマイナス80度に見つからない凍結乾燥サンプル内の凝集体の存在を明らかにする。
グルクロニダーゼアッセイの前に、遊離酵素を小胞から取り除くことが重要です。したがって、小胞精製に使用される技術を徹底的に評価する必要があります。精製粒子は、その表面電荷の観点から、貯蔵が膜タンパク質または糖の天然組成を変化させたかどうかを調べることもできます。
我々の技術により、細胞外小胞の貯蔵安定性に関する最初の指標を得ることは可能であり、その活性に関する既知のマーカーまたはアッセイがない場合でも利用可能である。
