وقدم التمويل لهذا العمل من خلال جمعية القلب الأمريكية (16SDG29870005) وولاية كارولينا الشمالية الدولة الجامعة للبحث والابتكار التمويل الأولى.

1-يوم 1: الخلية وإعداد كاشف ملاحظة: ينبغي أن يقوم جميع إعداد الخلية وكاشف في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع تلوث العينات.
<ol><li>بتصفية الحار دولبيكو &#39; s النسر التعديل &#39; s المتوسطة (دميم)، المصل البقري الجنين (FBS)، ل الجلوتامين، والبنسلين/ستربتوميسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد المواليد البشرية عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية (هدفن) وسائط الإعلام باستكمال استعد دميم مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين 1% 1% لتر-الجلوتامين.</li>
	<li>ذوبان قنينة مجمدة هدفنس والطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 200 x ز لإزالة المتوسطة للواسمات. ريسوسبيند الخلايا في استعداد هدفن الوسائط في كثافة 1 × 10 6 خلايا/مل والبذور في قارورة ثقافة T-75.</li>
	<li>قارورة مكان في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO 2) للسماح بانتشار الخلايا.</li>
	<li>"هدفن تخزين" الوسائط في 4 ° C.</li>
	<li>إعداد الكواشف للمحترفين ومكافحة migratory حسب الحاجة.</li>
</ol> 2. يوم 3: إعداد كروي <ol><li>القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.</li>
	<li>عندما تصل الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، نضح وسائط الإعلام، وإضافة 5 مل من 0.25% يدتا التربسين. قارورة مخزن في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من سطح قارورة كاملة-</li>
	<li>إضافة 5 مل من وسائل الإعلام المعالجون بقارورة لتحييد التربسين.</li>
	<li>في أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط 10 ميكروليتر تريبان الأزرق و 10 ميكروليتر من تعليق خلية.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية الأصلي لمدة 8 دقائق في 200 غ. س</li>
	<li>بينما هو يجري فصل تعليق خلية، إضافة 10 ميكروليتر من تعليق خلية تريبان الأزرق إلى هيموسيتوميتير وإجراء حساب خلية.</li>
	<li>عقب الطرد المركزي، نضح وسائل الإعلام دون إزاحة بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه الخلية بتركيز 1.25 × 10 5 خلايا/مل.</li>
	<li>إضافة 5 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) إلى الجزء السفلي من 10 سم طبق بيتري الحفاظ على بيئة المائية خلال النمو كروي.</li>
	<li>عكس غطاء طبق بيتري. إضافة عدة قطرات ميكروليتر 20 من تعليق خلية على السطح الداخلي للغطاء طبق بيتري.</li>
	<li>بسرعة عكس الغطاء مرة أخرى ووضعه مرة أخرى على الجزء السفلي من الطبق، مع الحرص على عدم إزاحة قطرات معلقة. ويبين الشكل 1 معلقة بنجاح تشكيل قطرات.</li>
	<li>بعناية وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية وتسمح الماغنيسيوم تنمو في شنقاً إسقاط ثقافة لمدة 72 h.</li>
</ol> 3. يوم 6: تضمين الماغنيسيوم في مصفوفة 3D <ol><li>القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.</li>
	<li>لتشكيل أول طبقة فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة من حجم كاف لإضافة 100 ميكروليتر الحل تجلط الواحد جيدا للعديد من الآبار كالمطلوبة (كروي 1 كل بئر). وتتألف من 10% 10 X HEPES المخزن المؤقت جلطات بحجم (250 ملم حبيس، 1500 ملم كلوريد الصوديوم، كاكل 50 مم 2، الرقم الهيدروجيني 7.4) والفيبرينوجين البشرية 2 مغ/مل U/mL 0.1 البشرية ثرومبين ألفا. ما تبقى حجم جلطة تتكون من الماء عالي النقاوة.
	<ol><li>ثرومبين إضافة آخر وبسرعة إضافة الحل إلى الآبار المرغوبة في لوحة 48-جيدا من أجل منع الجلطات مبلمرة قبل إضافتها إلى الآبار.</li>
	</ol></li> <li>بلطف يهز/والاستفادة من لوحة جيدا لضمان أن فيبرينوجين جلطة الخليط هو دهان الكامل جيدا، ثم ضع لوحة جيدا في الحاضنة ح 1 للسماح للطبقة السفلي تجلط بلمرة. لا تهز لوحة جيدا ما يكفي من الثابت للحث على تشكيل فقاعة؛ لوحة الصخور ببساطة حسب الضرورة حتى يتم المغلفة بأكملها شكل جيد. إذا استخدمت وحدات تخزين أكبر من جلطة، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية.</li>
	<li>نقل الماغنيسيوم إلى طبقة فيبرينوجين-
	لوحة <ol><li>إزالة جيدا وطبق بتري يحتوي على الماغنيسيوم في الشنق إسقاط ثقافة من الحاضنة ودراسة الماغنيسيوم تحت مجهر. ثم ضع الطبق إلى هود الثقافة-</li>
		<li>بعناية عكس غطاء صحن بيتري للسماح بالوصول إلى الشنق إسقاط الثقافات.</li>
		<li>بعناية باستخدام إبرة ز 21 المرفقة بحقنه 1 مل، نقل قطره واحدة من غطاء مقلوب داخل المركز من كل جيدا، مع الحرص على عدم ثقب طبقة فيبرينوجين مبلمرة طلاء أسفل البئر. فعالية نقل القطرة، سحب ببطء الانخفاض في الإبرة. وقف سحب المكبس مرة أخرى في أقرب وقت إسقاط كامل داخل الإبرة؛ سحب القطرة بعيداً جداً قد يعرض فقاعات الهواء، والتي يمكن أن تعطل نقل كروي فعالة أو تصوير اللاحقة-</li>
		<li>دراسة لوحة جيدا تحت مجهر للتأكد من أن الماغنيسيوم قد تحول بشكل صحيح في آبار كل المطلوب.</li>
	</ol></li> <li>لتشكيل الطبقة الثانية فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة آخر باستخدام إعداد نفس النحو الوارد أعلاه لإنشاء طبقة فيبرينوجين الأولى (الخطوة 3، 2). "الماصة؛" 100 ميكروليتر إلى كل قطره المحتوية على كروي بعناية ودراسة تحت مجهر مرة أخرى للتأكد من أن الماغنيسيوم لا تزال على حالها، ولا تم دفعها على حواف الآبار-</li>
	<li>إرجاع لوحة جيدا للحاضنة والسماح للطبقة الثانية بلمرة حاء – 1</li>
</ol> 4. يوم 6: إضافة برو المهاجرة أو العوامل المثبطة <ol><li>وسائل الإعلام "هدفن الحارة" إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>الخطوات التالية في غطاء لمنع التلوث.</li>
	<li>إعداد الوسائط لكل مجموعة بما في ذلك تركيزات ملائمة لوكلاء برو-migratory المضادة تقييم-</li>
	<li>إزالة لوحة جيدا من الحاضنة ومكان في غطاء ثقافة-</li>
	<li>ميكروليتر 500 إضافة وسائط القياسية لكل بئر من السيطرة على المجموعة كروي و 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام المثبطة لكل بئر فريق كروي تثبيط الهجرة 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام الموالية المهاجرة لكل بئر فريق كروي تعزيز الهجرة-</li>
	<li>إرجاع لوحة جيدا للحاضنة.</li>
	<li>تغير وسائل الإعلام كل حاء 48</li>
</ol> 5. 6-9 أيام: التقييم للهجرة الخلية وانتشار الماغنيسيوم <ol><li>الصورة باستخدام الفحص المجهري برايتفيلد فورا بعد إضافة الوسائط (ح 0) وبعد ذلك كل 24 ساعة ل h. 72 اختياري: عند كل نقطة من الزمن، تأخذ صورة z-كومة من أجل تحديد ما إذا كان يتم حدوث الهجرة في الطائرات خارج مجال التركيز الرئيسي. في تجربتنا لا يحدث هذا؛ ومع ذلك، أنها مفيدة لضمان هذا هو الحال في كل تجربة.</li>
	<li>"استخدام إيماجيج" لتحديد الخلية ثمرة في كل بئر من خلال تحليل الزيادة المئوية في المجال لكل كروي بتتبع الحدود خلية لكل كروي عند كل نقطة الزمنية المتعاقبة واستخدام &#34; التدبير &#34; الدالة للحصول على المجال.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration.">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619 (2015).</li><li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy.">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Lead+the+Way:+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility.">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Models+for+the+Study+of+Cutaneous+Wound-Healing.">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Z&#228;nker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix.">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound.">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li><li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots:+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration.">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li><li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin-based+biomaterials:+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level.">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li><li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem/precursor+cells+(MSCs)+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique.">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).</li><li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts.">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يسمح هذا البروتوكول لدراسة الهجرة الخلية في التئام المرتبطة ECMs من خلال في المختبر نموذج الثلاثي الأبعاد. خطوة حاسمة في التنفيذ السليم لهذا الإجراء هو التنمية السليمة الماغنيسيوم تنتجها الخلايا الليفية؛ تركيز خلية أثناء إعداد الأمثل لتعطي بتركيز أولية من الخلايا 2,500 والإفلات، مما يسمح الماغنيسيوم بشكل موثوق على مدى فترة حضانة المرض من ح 72. إذا كان يتم استخدام عدد كاف من الخلايا، لا يجوز تجميع فعالية الماغنيسيوم وقد التفكك عند يتم نقلها وجزءاً لا يتجزأ في طبقات فيبرينوجين. إذا كان يتم استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، قد يكون تركيز الخلية الأولى و/أو كروي إنضاج الوقت الواجب تعديلها بغية الحصول على تشكيل كروي متسقة ومستقرة. لأنواع الخلايا التي تتكاثر ببطء أكثر من الخلايا الليفية، قد تكون أعلى كثيرا تركيز خلية أولية اللازمة لضمان تشكيل كروي السليم خلال 72 ساعة الزمنية. لا ينبغي أن تظل الخلايا في شنقاً إسقاط ثقافة أطول من 72 ح بسبب عدم القدرة على تغيير وسائل الإعلام على الماغنيسيوم بينما في الثقافة. الاختلافات في حجم كروي الأولية المتوقع بسبب التقلبات البيولوجية المتأصلة؛ علينا معالجة هذا التغير بدءاً بتشكيل كروي عدد ثابتاً من الخلايا تقليل حجم الخلافات بقدر الإمكان، وتطبيع النمو مع مرور الوقت للسماح بإجراء مقارنات البيانات.
أن التحدي الأساسي لتنفيذ هذا الأسلوب هو نقل الماغنيسيوم من شنقاً إسقاط الثقافة في المصفوفة جلطة. يستخدم هذا البروتوكول الإبر والمحاقن لنضح الحبرية المحتوية على كروي من غطاء صحن بيتري مقلوب، ولكن يمكن أيضا أن تطبق أساليب أخرى، مثل استخدام الملقط أو ميكروبيبيتيس تعلق على نصائح المشذبة، فعالية نقل إسقاط الماغنيسيوم من معلق للمصفوفة. يمكن نقل الماغنيسيوم موثوق بها عن طريق سحب المكبس للمحاقن الخلف قليلاً قبل نقل الحبرية، وضمان أن الحبرية توضع في الإبرة ببطء حيث أن عدم إدخال فقاعات الغاز في الحبرية. المكبس حقنه ينبغي إلا تكون انسحبت ما يكفي لتحقيق كامل الحبرية الإبرة؛ سحب أي زيادة سوف أيضا إدخال فقاعات وتتداخل مع نقل الماغنيسيوم موثوقة إلى الآبار التي بليت جيدا. معلقة المتخصصة إسقاط ثقافة لوحات يمكن أيضا أن تستخدم من أجل تبسيط ثقافة كروي، ولكن أقل تكلفة وسيلة فعالة للقيام بذلك من استخدام ببساطة طبق قياسية.
خلال الجرح الشفاء في فيفو، إنتاج الخلايا الليفية التي تغزو منطقة الجرح البروتياز سيرين واسعة النطاق التي تسفر عن تدهور مصفوفة فيبرينوجين. وفي وقت لاحق توليف هذه الخلايا المصفوفة خارج الخلية الجديدة، تتألف أساسا من الكولاجين، بغية إصلاح الأنسجة التالفة. 23 هذه الآلية للهجرة يسمح لغزو الخاضعة للرقابة التي لم يتم التقاطها بواسطة أسلوبنا ويمثل قيداً للنظام. تجدر الإشارة أيضا إلى أن الخلايا الليفية المستخدمة في هذا الأسلوب سوف تفرز البروتياز التي سيكون على مر الزمن تتحلل بشبكة فيبرينوجين؛ ولذلك، إذا كان الأجل الطويل (&gt; 72 ساعة) المرغوب فيها دراسات الهجرة، مثبطات البروتياز، مثل أبروتينين، ينبغي أن تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر هذا الأسلوب طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه لدراسة الخلية 3D الهجرة في المختبر. بينما تحتفظ توفير بيئة ذات صلة أكثر فسيولوجيا من نماذج 2D استخداماً، وتحليل النمو في النموذج الثلاثي الأبعاد المبينة في هذا التقرير تحليل مستقيمة توفرها نماذج ثنائية الأبعاد. الماغنيسيوم من السهل تصور استخدام الفحص المجهري برايتفيلد أو مرحلة بسيطة، وإذا رغبت في ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذا الأسلوب لاستخدامه في الفحص المجهري الأسفار بوسم فلوريسسينتلي أغشية الخلية والبروتينات مصفوفة. هذا البروتوكول استخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية الأطفال حديثي الولادة بسبب دور الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في الأنسجة إصلاح/إعادة عرض. إذا رغبت في ذلك، العَدلات، الضامة، والخلايا الكيراتينيه أو أنواع الخلايا الأخرى يمكن استخدام في هذا التحليل لتقييم كيف تؤثر التعديلات في هيكل فيبرينوجين جلطة على هجرة أنواع الخلايا الأخرى المعنية في التئام الجروح. مواد ثلاثية الأبعاد كما يمكن تعديلها حسب الحاجة؛ اعتماداً على التطبيق المطلوب، قد تستخدم الكولاجين أو غيرها من المواد مصفوفة ثلاثية الأبعاد بدلاً من مصفوفة فيبرينوجين بغية تقديم نموذج فسيولوجيا ذات صلة. يمكن الحصول على نموذج مفيد لدراسة الهجرة الخلية الأطول أجلاً في بيئة شبيهة بالجرح بهذا البروتوكول باستخدام الخلايا الكيراتينيه والكولاجين بدلاً من الخلايا الليفية وفيبرينوجين. الأساليب الموصوفة أيضا السماح بقدر أكبر من المرونة والفعالية من حيث التكلفة في الهجرة الخلية والجرح الشفاء الدراسات من خلال تنفيذ نموذج فسيولوجيا ذات الصلة في المختبر بدلاً من طلب العمل الفوري في فيفو وبعد الدراسات الكلاسيكية ثنائي الأبعاد في المختبر .

التئام الجروح هو عملية معقدة مما يؤدي إلى استعادة سلامة الأنسجة بعد الإصابة. يتم تقسيم هذه العملية إلى أربع مراحل متداخلة يشملها الأرقاء والتهاب والانتشار ويعيد البناء، التي يتم تنظيمها بكل بمزيج معقد من الرموز القابلة للذوبان والخلية-مصفوفة التفاعلات والاتصالات خلية. 1 , 2 تزامن هذه الرموز يتحكم العديد من الاستجابات الخلوية في التئام الجروح بما في ذلك، الأهم من ذلك، الهجرة الخلية. 3 , 4 الهجرة الخلية عملية ديناميكية للغاية تعتمد على تعمل الخلوية والخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للوسط المصفوفة خارج الخلية. 5 الخلايا باستمرار التحقيق بيئتهم المصفوفة خارج الخلية من خلال مسارات إنتغرين بوساطة؛ تسمح هذه العملية الخلايا بمعنى مجموعة واسعة من خصائص المصفوفة بما في ذلك التضاريس والصلابة، والحبس. ثنائي الأبعاد (2D) تحليل الهجرة خلية يوضح أن الهجرة هو القوة الدافعة وراء تشكيل لاميليبوديا في طليعة من خلال توليد حزم خيوط الأكتين. اللاحقة تشكيل الالتصاقات المحورية في طليعة، في تركيبة مع أكتوميوسين مدفوعة انكماش وتراجع في الحافة، محركات أقراص الخلية إلى الأمام. 6 الهجرة الخلوية "ثلاثي الأبعاد" (3D) حاليا ليست مفهومة جيدا، إلا أن الدراسات الأخيرة تبين بأن الهجرة 3D اختلافاً مما ضوئها وصف الآلية في 2D، والمرجح أن تحركها آليات بديلة. على سبيل المثال، الدراسات الحديثة من بيتري وآخرون. أظهرت أن الخلايا في مصفوفات ثلاثية الأبعاد يمكنك التبديل اعتماداً على خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة، بين لاميليبوديوم ولوبوبوديوم مدفوعة آليات الهجرة. 7 نظراً للهجرة الخلية عنصر حاسم للجرح شفاء استجابة، نماذج ثلاثية الأبعاد للهجرة الخلية ذات أهمية حاسمة لفهم الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات المختلفة أثناء التئام الجروح. على الرغم من أن سلوك الخلية المهاجرة على الأسطح 2D ثبت أن تختلف اختلافاً كبيرا من الهجرة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد، الأكثر حداثة في المختبر نماذج الهجرة الخلية خلال الجرح شفاء العملية، بما في ذلك الفحص الصفر الراسخة، الاستفادة من 2D أحادي الطبقة الثقافات. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 فحوصات أكثر وضعت مؤخرا استخدمت مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ولكن لا تزال الثقافة الخلايا في أحادي الطبقة على رأس المصفوفة، مما يحد من القدرة على الخص حقاً ثريديمينسيوناليتي البيئة خلية المجراة في. 15
وغرض الأسلوب الموصوفة هنا دراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة الفيزيولوجية، وليس على سطح ثنائي الأبعاد، بغية التوصل إلى فهم أكثر قوة للردود الهجرة المرتبطة بالمنبهات التطبيقية. يسمح هذا الأسلوب للتقييم للهجرة الخلية داخل مصفوفة 3D فيبرينوجين جلطة حضور عوامل تنشيط أو تمنع المسارات المرتبطة بالهجرة الخلية. مصفوفة فيبرينوجين تم اختياره لهذا الأسلوب بسبب اللعب فيبرينوجين دوراً حاسما في المراحل المبكرة من التئام الجروح؛ الإصابات التالية، جلطة فيبرينوجين تتشكل داخل بيئات الجرح لوقف فقدان الدم ويعمل سقالة لتسلل خلية أولية أثناء إصلاح الأنسجة وإعادة عرض. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , بالإضافة إلى ذلك، 20 فيبرينوجين يستخدم سريرياً كتسرب جراحية وتكوين السدود قد تم مرتبطة بالهجرة الخلية، وفي نهاية المطاف نتائج الشفاء. دراسة سابقة أجرتها كوكس وآخرون. التحقيق الهجرة تنتجها الخلايا الليفية بجلطات فيبرينوجين تتألف من فيبرينوجين متفاوتة وتركيزات ثرومبين غرض الاستفادة المثلى من تسرب فيبرينوجين. في هذه الدراسات، وكان كمياً هجرة الخلايا من جلطات فيبرينوجين على الأطباق البلاستيكية. 20 هنا نقدم أسلوب يسمح للتحديد الكمي لهجرة خلايا داخل بيئة فيبرينوجين 3D. بينما يستخدم الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول تحديداً فيبرينوجين، يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة استخدام مواد بديلة المصفوفة كما هو مطلوب، مثل الكولاجين أو المصفوفات الأخرى 3D. بالإضافة إلى ذلك، نقدم استخدام تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم في هذا التحليل لأن الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في السرير الجرح أمر بالغ الأهمية لتوليف المصفوفة خارج الخلية والأنسجة إصلاح/إعادة عرض. ومع ذلك، هي العَدلات العملية خلال الإصلاح نوع الخلية الأولى ترحيل إلى السرير الجرح، وتليها الضامة. ثم تبدأ الليفية للتسلل البيئة الجرح حوالي 48 ساعة بعد الإصابة الأولية، في بداية المرحلة التكاثري للجرح شفاء العملية. 19 هذا التحليل يمكن تعديلها بسهولة لتضمين العَدلات، الضامة، أو أنواع الخلايا الأخرى لتقييم كيف تؤثر التغييرات في هيكل فيبرينوجين جلطة الهجرة أنواع هذه الخلية. 21
لتنفيذ هذا التحليل، أولاً، تتشكل كروي تنتجها الخلايا الليفية استخدام تعديل التقنيات الموضحة سابقا لزراعة الخلايا الجذعية. 22 كروي تنتجها الخلايا الليفية بعد ذلك نقل إلى مصفوفة فيبرينوجين 3D، وثمرة يمكن ثم بسهولة رصدها وقياسها كمياً على مدى عدة أيام. يأخذ هذا البروتوكول في حساب 3D النظم الفسيولوجية عن طريق تضمين الماغنيسيوم خلية ثلاثية الأبعاد داخل مصفوفة فيبرينوجين، وبالتالي تجنب أوجه القصور في الأهمية الناجمة عن استخدام سطح نمو 2D مع أحادي الطبقة خلية للسلوك النموذجي المهاجرة، في حين لا يزال يسمح لتقييم سلوك الخلية في بيئة عالية التي تسيطر عليها في المختبر .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Materials&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM already containing L-glutamine can also be used</td></tr><tr><td>100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Dishes of any size can be used for hanging drop culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Can be replaced with other cell type of interest</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2&#039; needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Syringes of any volume can be used</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td><td>VWR</td><td>82051-004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Can be replaced with matrix protein of interest</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>May not be necessary depending on matrix protein of interest</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 cell culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with 10X objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

حاليا، معظم نماذج في المختبر لالتئام الجروح، مثل فحوصات الصفر الراسخة، تشمل دراسة إغلاق الخلية الهجرة والجرح على السطوح ثنائية الأبعاد. ومع ذلك، البيئة الفسيولوجية في الجرح الذي في فيفو الشفاء يأخذ مكان ثلاثي الأبعاد بدلاً من الأبعاد. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن سلوك الخلية يختلف إلى حد كبير في الأبعاد مقابل بيئات ثلاثية الأبعاد؛ ولذلك، هناك حاجة للنماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا في المختبر لدراسة سلوك الهجرة الخلية في إغلاق الجرح. الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد التي تعكس بصورة أفضل الظروف الفسيولوجية من فحوصات الصفر ثنائي الأبعاد المحددة سابقا. والغرض من هذا النموذج تقييم ثمرة الخلية عن طريق فحص الهجرة الخلية بعيداً عن جسم كروي مضمنة داخل مصفوفة فيبرينوجين حضور عوامل برو أو مكافحة ميجراتوري. باستخدام هذا الأسلوب، ثمرة خلية من جسم كروي في مصفوفة ثلاثية الأبعاد يمكن ملاحظتها وهي قابلة للقياس بسهولة مع مرور الوقت عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد وتحليل لمنطقة جسم كروي. يمكن أيضا تقييم تأثير العوامل الكثيرة الارتحال برو و/أو المثبطة على الهجرة الخلية في هذا النظام. يوفر هذا الأسلوب الباحثين مع طريقة بسيطة لتحليل الهجرة الخلية في الجرح ثلاثي الأبعاد المرتبطة المصفوفات في المختبر، مما يزيد من أهمية المختبر في الخلية دراسات مسبقة لاستخدام الحيوانات في فيفو نماذج.

ثقافة كروي يمكن أن تستخدم لتقييم أثر العوامل المؤيدة والمناهضة الهجرة على الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في المختبر بنجاح يمكن أن تتكون الماغنيسيوم 3D تنتجها الخلايا الليفية عبر الشنق ثقافة الإفلات على مدى فترة 72 ساعة (الشكل 1). وعقب فترة الثقافة، الماغنيسيوم المضمنة داخل المصفوفة تجلط وتصويرها باستخدام مجهر برايتفيلد (الشكل 2). المناطق الأولية من الماغنيسيوم (المبينة في الشكل كمجالات محدودة بحدود بيضاء) مصممة باستخدام إيماجيج وتستخدم كنقطة مرجعية لتحديد درجة ثمرة الخلية اللاحقة من الهيئات كروي. تم تحديد القياسات الأولى متوسط المساحة الماغنيسيوم لتكون 4.3 × 104 ميكرومترات2 ± 1.1 x 104 ميكرومترات2 للتحكم الماغنيسيوم، 4.4 × 104 ميكرومترات2 ± 1.1 x 104 ميكرومترات2 للمحترفين المهاجرة الماغنيسيوم، و 4.5 × 104 ± 7.7 × 103 ميكرومتر2 الماغنيسيوم المناهضة الهجرة. الوسائط التي تحتوي على عوامل برو أو مكافحة migratory أضيفت إلى جلطات المحتوية على كروي، وثمرة خلية من جسم كروي الأولى تم تصويرها كل 24 ساعة، مع الصور النهائية المتخذة ح 72 بعد أن تمت إضافة الوسائط الأصلية (الشكل 3).
عند الانتهاء من هذه التجربة، وقد تم تحليل نمو كروي على مر الزمن باستخدام إيماجيج لحساب التغيرات في مجال كروي لكل عينة. كما هو موضح في الشكل 3، استخدمت الحافة الأبعد من الكتلة الخلية عند كل نقطة الوقت لتحديد درجة محددة من ثمرة الخلية. ونحن نتوقع أن بقع خارج نطاق التركيز هو موضح في الشكل 3 خلية الحطام، ولم نعتمد هذا في أعمالنا الكمي. وتظهر الصور كاملة الحجم حد خلية واضحة ومستمرة الخارجة من جسم كروي؛ فمن هذه الحدود التي يتم إرجاعها عند تحديد ثمرة. كان كمياً ثمرة الخلية بتطبيع المنطقة ثمرة الخلية بالنسبة لمنطقة جسم كروي الأصلي في t = 0 ح، وثم تعرب عن النمو كنسبة مئوية من منطقة كروي الأصلي. التحديد الكمي لثمرة الخلية على مدى فترة 72 ح يكشف أن الماغنيسيوم يتعرض لعامل برو المهاجرة يحمل درجة زيادة كبيرة من الهجرة بعيداً عن جسم كروي الأصلي بالمقارنة مع الماغنيسيوم يتعرضون عامل الهجرة المثبطة والماغنيسيوم التحكم يتعرضون لوسائل الإعلام القياسية (ف &#60; 0.0001، الرقم 4). على العكس من ذلك، أظهرت الماغنيسيوم يتعرض إلى عامل هجرة المضادة درجة انخفاض كبير للهجرة بعيداً عن جسم كروي الأصلي عند مقارنتها بمراقبة الماغنيسيوم (ف &#60; 0.0001).
للمقارنة، قدمنا مثالاً مقايسة الصفر (الشكل 5). أجرى هذا التحليل من قبل البذر الليفية في 500,000 الخلايا/سم2 في بئر 24-لوحات المطلي مع الفيبرينوجين 2 ملغ/مل. وسمح الليفية تنمو بين عشية وضحاها. ثم تم خدش السطح جيدا مع تلميح ماصة، والهجرة الخلية إلى منطقة التسويد تم تصويرها على مدار 24 ساعة. كما هو موضح في الصور الممثل في الشكل 5ألف، هناك حدود لهذا التحليل؛ لا خدوش استنساخه جداً وفي بعض الحالات، الحدود هي عدم وضوح. بيد اتجاهات الهجرة عموما حضور عوامل برو ومكافحة migratory هي نفسها كتلك موجودة في مقايسة كروي ثلاثي الأبعاد، على الرغم من تقلب السالفة الذكر، والاختلافات في أنماط الهجرة. تجدر الإشارة إلى أن معدلات الهجرة أسرع في مقايسة الصفر 2D، مقارنة بمقايسة كروي ثلاثي الأبعاد. الإغلاق كان أسرع حضور الوكيل برو-الهجرة وأغلقت جميع العينات مثقف حضور الوكيل برو المهاجرة تماما خلال 24 ساعة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig1.jpg"> 
الشكل 1 : الليفية الجلدية البشرية في شنقاً إسقاط الثقافة- يتم ترك الخلايا في شنقاً إسقاط ثقافة ح 72 للحث على تشكيل كروي. الأعلى (A) ومنظر جانبي (ب) معلقة إسقاط ثقافة ترد. (ج) التخطيطي يصور منظر جانبي لتشكيل كروي في قطره معلقة. الخط الأسود يمثل الجزء العلوي من اللوحة ومجال الوردي يمثل وسائل الإعلام ومجالات الأرجواني تمثل الخلايا داخل كروي. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig2.jpg"> 
الشكل 2 : مظهر كروي بعد تضمين الأولية في مصفوفة فيبرينوجين (t = 0 ح بعد إضافة وسائل الإعلام) تصويرها باستخدام المجهر برايتفيلد في 10 X التكبير. (أ، د) كروي التحكم؛ (باء، هاء) كروي يتعرض لعامل المناهضة الهجرة في وسائل الإعلام؛ (ج، و) كروي يتعرضون لوكيل هجرة المحترفين في وسائل الإعلام. يتم عرض الصور مع (د-و) ودون (أ-ج) الخطوط البيضاء التي تشير إلى الحدود المستخدمة لتحديد منطقة ثمرة. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig3.jpg"> 
الشكل 3 : مظهر كروي بعد 72 ساعة تصويرها باستخدام المجهر برايتفيلد في التكبير X 10- (أ، د) كروي التحكم؛ (باء، هاء) كروي يتعرض لعامل المناهضة الهجرة في وسائل الإعلام؛ (ج، و) كروي يتعرضون لوكيل هجرة المحترفين في وسائل الإعلام. يتم عرض الصور مع (د-و) ودون (أ-ج) الخطوط البيضاء التي تشير إلى الحدود المستخدمة لتحديد منطقة ثمرة. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig4.jpg"> 
الشكل 4 : كروي النمو ما يزيد على 72 h. وكلاء برو-الهجرة والهجرة المضادة في وسائل الإعلام تظهر أن يؤثر بشكل ملحوظالهجرة تنتجها الخلايا الليفية والانتشار في بيئات 3D. N = 3/المجموعة؛ * يمثل ف &#60; 0.0001. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig5.jpg"> 
الشكل 5 : مقارنة للمقايسة الصفر 2D القياسية. (أ) صور الممثل للهجرة الخلية في مقايسة الصفر معيار أكثر من 24 ساعة. كانت تزرع الليفية في وسائل الإعلام مكيفة مع عوامل برو أو مكافحة migratory، وتم قياس كمية الاختلافات في إغلاق الصفر على مر الزمن. (ب) النسبة المئوية الإغلاق على مر الزمن للخلايا الليفية التي نمت في السيطرة، المهاجرة برو، أو وسائل الإعلام المناهضة الهجرة. على الرغم من أن هناك اختلافات في أنماط الهجرة الحالية في هذا التحليل 2D مقابل المقايسة كروي ثلاثي الأبعاد، الاتجاهات العامة للهجرة تبقى ثابتة. N = 3/المجموعة؛ * يمثل ف &#60; 0.05. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments at JoVE.com

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K Views.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.

Video: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

جهاز لأداء الهجرة خلية / شفاء الجروح في لوحة 96-حسنا

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Developmental Biology

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Immunology and Infection

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

مجهرية على أساس أساليب التقييم للهجرة الخلية الظهارية أثناء التئام الجرح في المختبر

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medicine

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biology

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

فحص الهجرة الصفر وغرفة الجلد السمرة لتحليل في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء الجروح

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

تحديد هجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد داخل وإلى المواد الحيوية هيدروجيل الحبيبية

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...