The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

<html> 1. تربية عزت. الكبار بعوض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يفقس البيض في حوالي ¾ بوصة المياه في صينية ضحلة. سوف الاكتظاظ تقليل حجم البالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليرقات الخلفية عند 25 ° C (12-HL: 12-HD)، وإطعام الطعام الأسماك الأرض. ملاحظة: الإفراط في الغذاء قد يقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرانق بشكل فردي عن طريق ماصة باستير يوميا ونقلها إلى أطباق البلاستيك (9 سم × 5.5 سم) داخل الدلاء الاحتواء صغيرة مع الأغطية شبكة غرامة، وبالتالي إنشاء 24 تجمعات سن ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البعوض البالغ تغذية 10٪ محلول السكروز بواسطة كرة من القطن وضعت على جدران شاشة السكن قفص البعوض في غرفة البيئية في 27 ° C والرطوبة النسبية 70٪ تحت نفس الضوئية واليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالكهربية، استخدم 5-10 الحيوانات القديمة اليوم. بشكل عام، فإن الحيوانات الكبيرة تنتج نتائج أفضل. لعزل الحمض النووي الريبي، واستخدام الحيوانات التي تدخل في نطاق واحد 24 ساعة تجمع العمر في نطاق من العمر 5-10 يوم. </li></ol>الحمار = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. إعداد مواد كيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز مناسب من بالكهرباء (مثل 1-10 ملم) الذي يتسبب الحد الأدنى من النشاط من الخلايا العصبية الحسية المحدد. 10 ملي كلوريد الصوديوم أو 1MM بوكل هي الشوارد معقولة لاختبار النشاط الأساسي عند بداية التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل لكل مادة كيميائية تجريبية في مذيب مناسب (إن لم يكن الماء، واستخدام الإيثانول أو DMSO) الذي ليس له أثر يذكر أو معدومة على تصاعد النشاط بالمقارنة مع بالكهرباء وحدها. تركيزات النهائي من 10٪ من الإيثانول أو 1٪ DMSO هي تركيزات انطلاق معقولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر المناسب (مثل الكينين للمرارة أو السكروز للالحلوة) المواد الكيميائية السيطرة التي تم وصفها جيدا ردع التغذية أو المنشطات في الحشرات. </li></ol> 3. الكهربية (تسجيل غيض 8؛ الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقطاب الزجاج شكل ميكانيكيا عن طريق سحب الزجاج الشعيرات الدموية. تحسين الحرارة وسحب إعدادات لسحب الزجاج لتشكيل recordi شكل بشكل مناسبأقطاب NG. كسر بعناية قبالة نهاية الزجاج الكهربائي باستخدام ملقط تشريح تحت المجهر لخلق قطب كهربائي طرف فتح التي هي واسعة بما يكفي لالمغلف Sensillum والهدف، ولكن صغيرة بما يكفي لتجنب الاتصال مع الهياكل المجاورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر، وتحديد بصريا عن طريق التشكل ووضع الهدف sensilla / Sensillum وللتأكد من التكرار من تسجيل معلومات سرية. الحيوانات الإعدادية للسماح بالوصول الحر إلى sensilla من زاوية دخول القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحشرات تخدير الكبار الباردة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تجنب الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية الطرفية عن التعرض المفرط لدرجات الحرارة الباردة. قطع شرائط ضيقة من شريط السلوفان مع شفرة الحلاقة على شريحة زجاجية. شل حشرة كاملة على شريحة زجاجية باستخدام شرائط ضيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل سلك التنغستن شحذ كيميائيا إلى القفص الصدري الظهري أو العين لتكون بمثابة مبال (الأرض) القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الزجاج الكهربائي في الخطوة 3.1 مع حل محفزة للاهتمام. باستخدام حقنة إدراجها، وملء غطاءillary من نهاية سحبت لفظة نهاية. نفض الغبار من جميع فقاعات الهواء، وعقد نهاية سحبت إلى أسفل. إدراج الأسلاك الفضية (chloriding اختياري) في الزجاج الكهربائي في الخطوة 3.1 لتكون بمثابة تسجيل وتحفيز الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الأقطاب الكهربائية إلى المضخم التي تم تصميمها لتسجيلات من الاتصال sensilla chemoreceptive في الحشرات. وهذا المضخم (300 هرتز، 3 كيلو هرتز ممر الموجة مرشح) تقليل الوقت تسوية للقبض على نشاط الخلايا العصبية أقرب إلى التحفيز مقدمة ممكن. جمع وتخزين وتحليل الإشارات الكهربائية باستخدام الحواسيب الصغيرة مجهزة برنامج تسجيل ارتفاع. ملاحظة: الأرضي الإعداد التسجيل بشكل صحيح قد يحسن بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز sensilla مع حل التحكم (المنحل بالكهرباء فقط) لضمان الأداء الوظيفي. عدد المسامير ابتداء من 200 ميللي ثانية بعد قطعة أثرية التحفيز لجميع الاستعدادات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بطريقة عشوائية ترتيب المواد الكيميائية اختبار لجميع التجارب، باستثناء دراسات الجرعة والاستجابة،للقضاء على التحيز. للدراسات الجرعة والاستجابة، فضح sensilla إلى زيادة تركيزات هذه المادة الكيميائية التجريبية. سماح لا تقل عن 3 دقيقة بين التحفيز لضمان استرداد كاف. ملاحظة: قد تختلف هذا الشرط اعتمادا على الحشرات وsensilla. ويعرف عتبة كما أن التركيز الذي لا تتداخل مع الخطأ المعياري الخطأ المعياري للاختبار أقل تركيز. </li></ol> 4. عزل RNA وتسلسلها (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المناسب بإحكام المدقات خالية من ريبونوكلياز عن طريق التبريد لهم على الثلج الجاف قبل الأنسجة disruption.Prepare المرافق المدقات خالية من ريبونوكلياز التي تناسب أنابيب غطاء مبكرة بإحكام. حافظ على أنابيب جمع مغلقة ما لم تشريح بنشاط لتجنب تكاثف الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الشافطة تصفيتها، ضع 30 إلى 40 البعوض الباردة تخدير (15 ثانية في الثلاجة -20 درجة مئوية) على خشبة المسرح الباردة والفرز حسب الجنس. مكان الحيوانات الظهرية الجانب السلبي، واستيعاب أجنحة للا ضرر الزوائد الذوق.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، تشريح labella الموثوقة أو الرصغي من الذكور أو الإناث تحت المجهر تشريح والحد إدراج الأنسجة المجاورة. ملاحظة: 500 labella يقترن ينتج حوالي 800-1،000 نانوجرام من إجمالي مرنا. 400 الرصغي الفردي (5 شرائح لكل منهما) تسفر 1،200-1،800 نانوجرام من إجمالي مرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج واحد من يلهث-ملقط، فهم طفيفة خرطوم البعوض فقط القريبة إلى labella تعريض قلم دقيق الداخلية. استخدام زوج آخر من جمع-ملقط، إزالة labella وإضافة إلى الأنسجة الجانب من أنبوب جمع البارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج واحد من ملقط، فهم طفيفة في الساق البعوض في تقاطع الساق وأول جزء الرصغي. استخدام زوج آخر من الملقط، وإزالة الرصغي وإضافة إلى الأنسجة الجانب من أنبوب جمع البارد. ملاحظة: خذ بعين الاعتبار أنواع الخلايا في واجهة من الأنسجة أراد وغير المرغوب فيها. في حين أنه من المهم للحد من إدراج الأنسجة المجاورة، من المهم أيضا أن لا حذف أجزاء من الأنسجة المطلوب. وفايعينة نال يجب أن تمثل بدقة الجهاز بأكمله من الفائدة. إنشاء حدود الدقيق مع ملقط استيعاب مثل هذا ملقط جمع يمكن تحرير بدقة عن طريق كشط أو الاستيلاء على الأنسجة المطلوب فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوري، وتدور أسفل أنبوب جمع لفترة وجيزة في 0 ° C الطرد المركزي في 9،000 x ج للحفاظ على الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا يتراكم الرطوبة في أنابيب جمع خلال تشريح، إضافة 50uL من كاشف Trizol البارد لتغطية الأنسجة التي تم جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المضادة للطخة مختبر علامة، تسمية بوضوح واحدة خالية من ريبونوكلياز 1.5 مل المفاجئة أنبوب غطاء لكل نوع الأنسجة لجمع. باستخدام 1.5 مل أنبوب رف والنيتروجين السائل، وتجميد ثم طحن الأنسجة الى مسحوق ناعم (القطع الجميلة إذا كان في Trizol). أكرر مرة واحدة. جلب إجمالي حجم Trizol إلى 1 مل و resuspend الأنسجة الأرض من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 UL من الكلوروفورم وتخلط جيدا. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتدور عليها في أجهزة الطرد المركزي في 4 ° C و11،000 x ج لمدة 15 دقيقة. بعنايةإضافة طبقة مائية مباشرة إلى عمود مرشح الحمض النووي الجيني. تدور باستمرار في 11،000 ز س لمدة 5 دقائق. إضافة حجم مساو من ريبونوكلياز خالية الايثانول 70٪ في التدفق من خلال وتخلط بواسطة الماصة. نقل السائل إلى عمود جمع RNA ومواصلة استخراج الحمض النووي الريبي فقا للتعليمات المقدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس وتقييم نقاء من إجمالي RNA على معمل الدقة والمضي قدما مع أي وسيلة RNA تسلسل قياسي. </li></ol> 5. الكمي RT-PCR RNA التحقق من صحة التسلسل (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر العديد من الجينات ممكن لمقارنة مستويات التعبير الجيني النسبية على نطاق ديناميكي، سواء في توقع وفرة تسلسل ويفترض وظيفة الجين حسي كيميائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزواج التصميم التمهيدي لكل الجين المستهدف لتضخيم 100-180 basepair PCR منتج معين. استبعاد التضخيم gDNA غير محددة من خلال ضمان التمهيدي واحد على الأقل لكل مجموعة يمتد على الحدود إنترون. بدلا من ذلك، استخدم العلاج الدناز للحد من التلوث الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمعالأنسجة الحشرات كما هو موضح في القسم السابق. حساب مقدار الأنسجة هو مطلوب لتوفير ما يكفي من RNA لاستكمال جميع ردود الفعل QRT-PCR. ملاحظة: سوف ثلاث نسخ البيولوجي وردود الفعل ثلاث نسخ الفنية توفير أقصى قدر من الثقة في النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الكمي الجين النسبي كما X الهدف - (ط م [الهدف] -Ct [إشارة]) لكل جينة المستهدفة والمتوسط ​​لكل تكرار، سواء البيولوجية والتقنية. استخدام الجينات التدبير المنزلي (ق) لتطبيع القيم ط بين مكررات البيولوجية وللقضاء على نطاق وY-axis في مقارنات التعبير النسبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تشابه RNA وما يليها ومجموعات البيانات QRT-PCR باستخدام القائمة على الانحدار، التمهيد إجراء التكافؤ 9، تطبيق تكرارا، إلى البيانات من كل الأنسجة. ملاحظة: يحدد هذا الإجراء أصغر &quot;المنطقة التشابه&quot; التي يمكن بناؤها حول البيانات RNA تسلسل وQRT-PCR الملحوظ، والسماح للالتعبير الجيني النسبي مقاسا qRT-PCR للنظر يعادل إحصائية لقياس التعبير الجيني النسبي التي كتبها RNA وما يليها. </li></ol>

<ol>
	<li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220,+picaridin,+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti,+Anopheles+stephensi,+and+Phlebotomus+papatasi.">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li><li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic.">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li><li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+chemosensory+appendages+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+reveals+tissue-+and+sex-specific+signatures+of+odor+coding.">Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding.</a> BMC Genomics. 12 (271), (2011).</li><li>Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding.">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).</li><li>Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+adult+Drosophila+antenna+by+high-throughput+sequencing.">Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing.</a> Zoological Studies. 52 (42), (2013).</li><li>Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., R&#252;tzler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+Aedes+aegypti+odorant+receptor+gene+family.">Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family.</a> Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).</li><li>Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odour+receptors+and+neurons+for+DEET+and+new+insect+repellents.">Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents.</a> Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).</li><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit.">The physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li><li>Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regression-based+equivalence+test+for+model+validation:+shifting+the+burden+of+proof.">A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof.</a> Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li><li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li><li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gr+family+of+candidate+gustatory+and+olfactory+receptors+in+the+yellow-fever+mosquito+Aedes+aegypti.">The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti.</a> Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).</li><li>Ramsk&#246;ld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundance+of+ubiquitously+expressed+genes+revealed+by+tissue+transcriptome+sequence+data.">An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data.</a> PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data.">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li><li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies.">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li><li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system.">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الجانب الأكثر تحديا من إمكانات العمل تسجيل من sensilla ذوقي هو الذي يقرر الردود هي &quot;طبيعية&quot;، وعندما تستخدم Sensillum واحدة الذوقية غيض تسجيل أول مرة لأنواع الحشرات معين، فإن العدد الإجمالي والحساسيات من الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية (GRNs) هي غير معروف على الأرجح. ويطلب العديد من التسجيلات الأولية لأول مرة لتحديد المدى وتركيزات المواد الكيميائية لاختبار. في هذا المثال، بدأنا مع ملاحظة أن GRN احد بالرد على تركيزات منخفضة من DEET (الشكل 1). وفي وقت لاحق، درسنا الاستجابات ضمن نفس Sensillum وإلى مجموعة من تركيزات المواد الكيميائية المعروفة لتكون مريرة أو مكره على الحشرات الأخرى، ولاحظ شكل ارتفاع مماثل والسعة (الشكل 1). وتشير هذه الملاحظات أن GRN نوع فرعي واحد يستجيب لهذه المركبات مكره. وعلى سبيل المقارنة، نحن اختبار المركبات السكرية المعروفة لتحفيز التغذية في mosquitoes لمعرفة ما إذا حدث ارتفاع مماثل. لاحظنا مختلفة، ارتفاع أكبر في هذه الحالة. وبالمثل، لاحظنا ذلك، ارتفاع متوسط ​​الحجم الثالث ردا على التحفيز الملح، ليصل بذلك إجمالي عدد GRN النوع الفرعي إلى ثلاثة. الاستعدادات تسجيل الكهربية في الحشرات متغيرة بطبيعتها. الهدف sensilla الذوقية وعادة ما تكون صغيرة جدا ويجب وضعه في زاوية المناسبة للوصول مع القطب تسجيل دون لمس الزجاج للبشرة. لإنشاء جسر موصل للالخلايا العصبية الذوقية، يجب أن تكون المسام محطة للSensillum ومفتوحة للالليمفاوية الواردة لتأسيس اتصال مباشر مع بالكهرباء القطب تسجيل في. وقد لاحظنا انسداد فتحات sensilla إما عن طريق الحطام أجنبي أو تفرز والمجففة المواد من داخل sensillum والهدف. لتجنب هذه العوائق، يجب توخي الحذر عند التعامل مع وتربية الحشرات لتجنب الاتصال مع sensilla الهدف. بالإضافة إلى تشوالغناء التالفة والحشرات اختبار صحية، والعوامل البيولوجية مثل العمر، والتغذية الدولة، التزاوج يجب أخذها في الاعتبار عند وضع ضوابط للحد من التقلبات في التسجيلات الدولة وzeitgeber الوقت. قد يكون من الصعب الحصول على إعداد استجابة باستمرار. قد يكون العديد من التجارب ضرورية لتحسين نسبة يكفي الإشارة إلى الضوضاء لحل المسامير على حدة. الاختلافات التجريبية على الاستعدادات المذكورة أعلاه قد يؤدي إلى نتائج أفضل. فإنه من المستحسن لإنشاء استجابة قوية على جهاز التسجيل الخاص بك لأنواع الاختبار الخاصة بك باستخدام المشترك ارتفاع elicitor الحشرات، مثل السكروز أو الكينين. مرة واحدة هو Sensillum والذوقية الاستجابة، وينبغي أن تكون هذه الاستجابات استنساخه. الحد الأدنى للطول الفترة الزمنية بين التحفيز وينبغي أن تحدد تجريبيا دراسة ديناميات ارتفاع في ظل القيود الزمنية المختلفة. وينبغي تجنب التحفيز المفرط للحفاظ على الصحة GRN ومنع تدهور الليمفاوية Sensillum و. في حالة ثاانخفاض حساسية ر استجابة بسرعة بعد التحفيز الأولى، يجب الحصول على عدد أكبر من محضرات لتوفير الثقة بأن هذه الاستجابات هي نموذجية من الناحية الفسيولوجية لنوع معين. ذوبان بعض المواد الكيميائية اختبار يمكن أن تخلق صعوبة في تحفيز كهربائي، حيث أن بعض المذيبات قد تؤثر على النشاط GRN، وحتى بتركيزات منخفضة النهائية. ويمكن معالجة هذه الاعتبارات من خلال التجربة والخطأ ومع الضوابط المناسبة. يجب إضافة أي مذيب يستخدم لالمنحل بالكهرباء السيطرة وحلول اختبارات أخرى لضمان اتساق الاستجابات. الحشرات الصغيرة شل حركة، وبالتالي توفير إمكانية الوصول المباشر لاستهداف sensilla دون الإضرار الأنسجة الهشة، قد تتطلب التجربة والخطأ. الحد الرئيسي للالكهربية هو فصل المؤسف الردود العصبية الملحوظة والاستجابات السلوكية المصب المحتملة. لذلك، فإنه من المفيد لاختبار الردود على المواد الكيميائية التي لبأظهرت التابعين لانتزاع استجابات سلوكية معينة من أجل مناقشة أهمية النتائج في سياق البيئي. تسجيلات تلميح تسمح لكشف دقيق جدا من النشاط الخلوي، مما يجعل هذه التقنية مثالية لتقييم الحيوانات المعدلة وراثيا أو تلك واظهار الاختلافات المظهرية في السلوك. كما تقدم هذه التسجيلات مزيد من المعلومات حول الاستجابات العصبية، مثل ديناميات الزمنية والسعة، من أنظمة الاعتماد على صحفيين البصري للنشاط الخلايا العصبية. في بعض الحالات، والاستجابات العصبية يمكن كميا بسهولة أكثر من البيانات السلوكية (12). جمع الأنسجة لRNA وما يليها وQRT-PCR واضح ومباشر ولكنها تتطلب التركيز المستمر والانتباه إلى الحفاظ على المواد الخلوية من خلال التخزين البارد وتجنب الرطوبة الزائدة. النشاط ريبونوكلياز يمكن أن تؤثر على نوعية الحمض النووي الريبي. لذلك يجب الأنسجة فقط الاتصال السطوح النظيفة في جميع أنحاء جمع واستخراج الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن استكشاف الأخطاء وإصلاحها مطلوب لQRT-PCR طق موثقة جيدا، تحدث مطبات على الأرجح في وقت مبكر من العملية عند تصميم الاشعال واختيار الهدف والتدبير المنزلي الجينات. الجينات التي تمثل متوقع نقاط متباعدة بشكل متساو على طول خط مستوى التعبير النسبي مفيدة لمقارنة الحمض النووي الريبي يليها ومجموعات البيانات QRT-PCR (الشكل 3). على سبيل المثال، اختيار الجينات لQPCR التي تظهر القيم RPKM 0، 10، 20، 30، الخ، على التوالي، وتقديم نظام يمكن التنبؤ به من وفرة لفحصها. كان RNA-يليها ناجحة إلى تسليط الضوء على متواضع التعبير عن الجينات في استطلاعنا الأنسجة الذوقية (الشكل 2). وبناء الجين يمكن الاعتماد عليها لعزت. جعلت بعوض (AaegL1.3، http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) واستقبال كيميائي مسبق الجين تحديد 14 سجل التعبير الجيني سهلة نسبيا. لهذه الأغراض، والحشرات مع شروح الجين المتاحة وعائلات الجينات التي تم تحديدها من الفائدة هي أنظمة نموذج القيمة. تحديد عتبة دقيقةللتعبير الجينات مقابل الضوضاء في الخلفية هو المضاربة، ولكن طرق تحديد انقطاع معقولة متاح 15-17. نحن هنا تحديد مستوى RPKM الثقة كاملة وعلى مستوى RPKM أقل من الثقة انخفض على أساس سابقة 9 ونحن هنا مؤطرة مناقشتنا للنتائج. في المستقبل، فإننا نأمل أن تشريح الأنسجة حسي كيميائي أخرى في كل من البعوض وغيرها من الحشرات الهامة اقتصاديا لتوسيع معرفتنا الجينات التوسط الحشرات صد. وقد أقمنا عدة جينات الذوقية المرشح التي هي الأكثر احتمالا التوسط الردود على المركبات مكره بمقارنة تسلسل الجيني لأنواع البيانات الوظيفية المتاحة مع 13. نحن توليد خطوط المعدلة وراثيا من البعوض في عداد المفقودين هذه الجينات حسي كيميائي الفردية. سوف نستخدم تسجيلات تلميح إلى تقييم دور هذه الجينات على قدرة الحيوان للكشف عن المواد الطاردة للتعرف وتقييم الاستجابات السلوكية لهذه المسوخ لrepellents. في المثال أن هذه الجينات مرشح لا تؤثر بشكل كبير صد، قد تكون أكثر القرار اللازم لتحديد أكثر دقة التعبير الجيني أو وجود البروتين في sensillum واحد أو خلية. متواضع المستقبلات التي أعرب عنها قد تكون أهدافا حاسمة لفحص المواد الطاردة للرواية، جنبا إلى جنب مع وأعرب بتواجد مطلق شارك في مستقبلات. لسوء الحظ، الموقع التهجين وimmunolocalization في وقد ثبت من الصعب بشكل لا يصدق في الأنسجة الذوقية الحشرات 18. بعد أن نكون قد أنشئت الجينات التي تتوسط هذه الاستجابات الفسيولوجية والسلوكيات، ونحن قد التعبير عن هذه الجينات في أنظمة الخلية التي هي قابلة للالإنتاجية العالية فحص المواد الطاردة للمرشح. في النهج سيليكون والتي تستخدم النمذجة الهيكلي 7 مايو أيضا أن تكون مفيدة في التنبؤ أي نوع من أنواع المركبات سوف تثير ردود قوية من مستقبلات محددة.

وقد أظهرت مركبات مثل DEET، Picaridin، Citronellal وIR3535 لصد البعوض بشكل فعال، بما في ذلك ناقلات الأمراض المهم الزاعجة المصرية 1،2. نسجل إمكانات العمل من الخلايا العصبية الحسية المرتبطة sensilla الذوقية محددة لتحديد الخلايا المشاركة مع البعوض صد. إلى جانب التسلسل المصب من الجينات التي أعرب عنها في هذه الأنسجة، ونحن قد التعرف على الجينات على الأرجح التوسط في ردود هذه الخلايا من أجل فحص مركبات جديدة لتحسين قدرات صد. RNA وما يليها هو أداة قوية، لتصبح بسرعة قياسية لتتبع التغيرات الزمانية والمكانية في التعبير الجيني. يحلل RNA وما يليها من الزوائد حسي كيميائي الحشرات واستخدمت أجهزة للكشف عن مستقبلات الجزيئية في العديد من أنواع الحشرات 3-5، وتحسين كبير على التقليدي القائم على PCR البحث الجين بواسطة الجينات 6. الحشرات تمثل الطبقة الحيوان الأكثر تنوعا، قبلsenting العديد من الفرص لدراسة العلاقة بين الجينات والظواهر فريدة من نوعها. ويمكن استخدام تكنولوجيا RNA وما يليها على أي نوع من الأنسجة الحشرات الحية. وبالمثل، تسجيل الكهربية من الخلايا الحسية داخل sensilla الذوقية uniporous لا يمكن أن يتحقق في كثير من أنواع الحشرات المختلفة. الاقتران من هذه التقنيات اثنين يسمح للباحثين لتضييق الجينات مجموعة تشارك في النمط الظاهري حسي كيميائي لوحظ. سوف الأنواع المختلفة تشكل تحديات محددة، ولكن قد تبلغ العلاقة بين جينات مستقبلة حسي كيميائي والتكيف حسي كيميائي. حجم ومورفولوجية حسي كيميائي sensilla هو متغير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تتطلب واسعة النطاق عند تسجيل إمكانات العمل للحد من الضوضاء وتحديد إشارات متكررة. تشريح أجهزة حسي كيميائي قد تكون تافهة أو حساسة تستغرق وقتا طويلا، اعتمادا على التشكل وحجم الحشرة. انتعاش عالية الجودة RNA قد تتطلب بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها كذلك، مثل تجنب بعض أصباغ خلالجمع الأنسجة. بينما يدل على آثار مركبات مضادة للمن خلال التجارب السلوكية غير المباشر والمفيد، وهذا النهج هو الوقت مكثفة واسعة فيما يتعلق بآلية العمل. الكهربية إلى جانب RNA-يليها تسمح للتحليلات أكثر تحديدا من ما يدفع السلوكيات تجنب في الحشرات. مرة واحدة وقد تم التعرف على &quot;أدوات&quot; التمييز الكيميائية في أنواع الحشرات، ومحاولات أكثر تحديدا لتحسين على المواد الطاردة للتعرف ممكنة. ويمكن التعبير عن مستقبلات والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحسية المسؤولة عن هذه السلوكيات heterologously للفحص الكيميائي المباشر. وعلاوة على ذلك، يمكن النمذجة الجزيئية ويتوقع المواد الكيميائية والتي سوف تثير ردود قوية من هذه المستقبلات 7. قد تكون لقطة من جميع الجينات النشطة في مجموعة ضيقة من الأنسجة حسي كيميائي مفيد أيضا في تحديد جينات مشابهة في الأنواع الأخرى. عن طريق التماثل تسلسل والتعبير سيmilarities، قد شكل الباحثون مجموعة من المستقبلات الجزيئية الأرجح التوسط الردود على المواد الطاردة التي هي فعالة على نطاق واسع على الحشرات. نقدم بروتوكول التالية لمساعدة الباحثين في تفكيك مسارات حسي كيميائي الحشرات وإقناع أكثر الخوض في neuroethology عدم نموذج والحشرات الهامة اقتصاديا.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

التسجيلات أثر للإمكانات العمل من عزت. sensilla الذوقية بعوض (الشكل 1) تثبت فعالية التحفيز المباشر مع مجموعة من المواد الكيميائية. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس ردود على أي مادة كيميائية محفزة عن طريق عد المسامير من السعة معين ومدة على نطاق وزمنية معقولة (عادة أقل من 500 مللي ثانية). يجب أن يكون التسجيلات تتبع استنساخه بسهولة في ظل مجموعة معينة من الظروف التجريبية. خلاف ذلك، قد الاستجابات الفسيولوجية لاحظ تمثل الظواهر شائعة بين الأفراد من الأنواع الاختبار. يتطلب بيانات RNA وما يليها الخام الترشيح ورسم دقيق قبل عرضها كما RPKM مدورة (عدد معين يقرأ في طول كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون يقرأ معين) أو FPKM (عدد شظايا قراءة في طول كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون يقرأ معين) القيم العددية (الشكل 2). التمييز بينوقد وصفت هذه الأساليب تطبيع يومين RNA وما يليها في عملين المنوية 10،11. ميزة واحدة من إجمالي تسلسل مرنا هي القدرة على الكشف عن التعبير عن الجينات الأسر كبيرة في وقت واحد. العرض المرئي للتعبير عن العديد من الجينات تسمح في آن واحد لفهم فريد من مجموعة أدوات الجزيئية للنسيج معين. مقارنات بين الجنسين، مراحل تطور أو أنواع الأنسجة ويمكن إجراء سريعا. قد تكون مكررات البيولوجية لمجموعات البيانات-RNA وما يليها محدودة التكلفة أو صعوبة جمع الأنسجة. تقدم QRT-PCR القدرة على التحقق من صحة فرعية صغيرة من إجمالي التعبير الجيني بتكلفة أقل ويتطلب أقل مصدر RNA. جنبا إلى جنب مقارنات البيانات (الشكل 3A) السماح لمزيد من الثقة في النتائج RNA وما يليها، كما طريقتين تعتمد على كيمياء مختلفة لتقدير وفرة الجين. وظائف التكافؤ الإحصائية (الشكل 3B) تظهر حدود اليقين في كل حالة. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig1highres.jpg" /> الشكل 1: التسجيلات الكهربية من sensillum والمتوسطة على labellum من عزت. إناث بعوض أو تعديل من العمل استشهد 12 وتظهر آثار الردود على 100 ​​ملي كلوريد الصوديوم، و 100 ملي السكروز، 1 ملم الكينين، 0.8٪ DEET، 0.8٪ Picaridin، 0.8٪ و 0.8٪ Citronellal IR3535. وصفت المسامير الثلاثة مع اختلاف سعة أو الأشكال أ، ب أو ج. هذه المسامير الثلاثة تتوافق مع ثلاثة أنواع فرعية الخلايا العصبية الحسية مع حساسيات مختلفة: الملح، والسكر، ومريرة، على التوالي. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig2highres.jpg" /> الشكل 2: جدول الذوقية التعبير مستقبلات الجينات على النحو الذي يحدده RNA-يليها لمدة 8 عينات الأنسجة، وتعديلها من العمل استشهد 13 خلايا فردية تقريرا القيم RPKM لكل الشرح الجين الذوقية والأنسجة الذكور (يسار) والأنسجة الإناث (يمين). يتم تقريب القيم العددية إلى أقرب عشر. توج للحرارة خريطة كثافة اللون في أعلى RPKM ويتم تحجيم منتصف لكل عائلة الجين بشكل فردي. هناك واحد فقط عائلة الجين هو مبين في هذه الحالة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig3highres.jpg" /> الرقم 3: مقارنة بين البيانات QRT-PCR RNA والبيانات وما يليها، معدلة من العمل استشهد 13 (A) كل الجينات استقبال كيميائي من المحور الأفقي يمثله أعمدة البيانات اثنين. العمود الأيسر يمثل التعبير النسبي على النحو الذي يحدده-RNA يليها. تم تقسيم القيم RPKM من الجينات استقبال كيميائي من قبل أن من الجينات التدبير المنزلي Aaeg LAsP لتوليد النسب العددية في هذه الأنسجة. الحقالعمود يمثل التعبير النسبي على النحو الذي يحدده QRT-PCR. أولا، تم تطبيع تكرار البيولوجي القيم ط م للجينات labella باستخدام Aaeg LAsP كمعيار. ثانيا، تكرار القيم ط م للاستخدمت كل الجينات لحساب القيم التعبير النسبية (الهدف E - (ط م [الهدف] -Ct [إشارة])). وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري للقيم التعبير النسبي المحسوب على حدة. وتمت مقارنة (B) RNA وما يليها وQRT-PCR مجموعات البيانات في تحليل منفصل. المحاور العمودية تمثل وفرة الجين النسبية كما يتبين من البيانات RNA وما يليها، بقيمة 1 تنسب إلى الجينات التدبير المنزلي Aaeg LAsP وجميع التعبير الجيني الآخر يجري ذكرت النسبية لهذه القيمة. المحاور الأفقية تمثل وفرة الجين النسبية كما تنبأ QRT-PCR، بقيمة 1 تنسب إلى الجينات التدبير المنزلي Aaeg LAsP وجميع التعبير الجيني الآخر يجري ذكرت النسبية لهذه القيمة. الخطوط الحمراء تمثل التكافؤ المحدد. الخطوط المتقطعة تمثل حدود &quot;المنطقة التشابه&quot; لمنحدر، وتحسب على أساس خوارزمية التكافؤ الإحصائية 9. خطوط سوداء صلبة تمثل الانحدار المربعات الصغرى من QRT-PCR التكافؤ إلى RNA وما يليها الكمي للجينات المستهدفة 12 و Aaeg LAsP الجينات التدبير المنزلي، يمثل كل نقطة بيانات الدائرة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

باستخدام طريقتين لتقدير التعبير الجيني في الزوائد الذوقية الرئيسية للبعوض Aedes aegypti، حددنا مجموعة من الجينات مزعومة الكامنة وراء الاستجابة العصبية لمركبات المريرة ومثير للاشمئزاز، على النحو الذي يحدده الفحص الكهربية.

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em&gt; الزاعجة المصرية</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K Views.  United States Department of Agriculture.  باستخدام طريقتين لتقدير التعبير الجيني في الزوائد الذوقية الرئيسية للبعوض Aedes aegypti، حددنا مجموعة من الجينات مزعومة الكامنة وراء الاستجابة العصبية لمركبات المريرة ومثير للاشمئزاز، على النحو الذي يحدده الفحص الكهربية. 

Video: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

تسجيلات Sensillum واحدة في الحشرات ذبابة الفاكهة السوداء البطن و الأنوفيلة الغامبية</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neuroscience

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط ​​من AE. بعوض البعوض

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

استخدام نظام GAL4-UAS لعلم الوراثة الوظيفية في أنوفيليس غامبيا

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Genetics

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

تسجيل الكهربية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; Labellar طعم الشعيرات

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

تغذية وقياس الدم المشتق من الحيوانات والوجبات الاصطناعية في البعوض Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Immunology and Infection

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

<meta charset="utf8"></head><body>التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

دليل خطوة بخطوة لتخطيط كهربية البعوض

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تسجيلات Sensillum واحدة في الحشرات ذبابة الفاكهة السوداء البطن و الأنوفيلة الغامبية

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط من AE. بعوض البعوض

استخدام نظام GAL4-UAS لعلم الوراثة الوظيفية في أنوفيليس غامبيا

تسجيل الكهربية من

طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي

تغذية وقياس الدم المشتق من الحيوانات والوجبات الاصطناعية في البعوض Aedes aegypti

التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،

دليل خطوة بخطوة لتخطيط كهربية البعوض

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تسجيلات Sensillum واحدة في الحشرات ذبابة الفاكهة السوداء البطن و الأنوفيلة الغامبية

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط ​​من AE. بعوض البعوض

استخدام نظام GAL4-UAS لعلم الوراثة الوظيفية في أنوفيليس غامبيا

تسجيل الكهربية من

طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي

تغذية وقياس الدم المشتق من الحيوانات والوجبات الاصطناعية في البعوض Aedes aegypti

التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،

دليل خطوة بخطوة لتخطيط كهربية البعوض

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط من AE. بعوض البعوض