Bu raporda açıklanan yöntem, sağlık ve hastalık durumlarında gönüllü işitmenin fizyolojik ve nöro-davranışsal yönlerini anlamak için kullanılabilir. Bu teknik, günün aydınlık ve karanlık evrelerinde fare hacmi davranışını izlememize olanak tanır ve işeme olayları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar. Gerçek zamanlı bir boşluk noktası testi veya RT-VSA kayıt odası hazırlamak için, RT-VSA kayıt kafesinin altına günün saatine bağlı olarak ince veya kalın bir filtre kağıdı yerleştirin.
Filtre kağıdının üzerine, uyku alanı için plastik bir iglo; zenginleştirme amacıyla steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve iki veya üç parça fare kuru çorbası içeren 60 mm x 15 mm'lik bir plastik tabak ve bir jel paketi şeklinde 14 ila 16 gram su yerleştirin. Kayıt odası hazır olduğunda, fareyi yavaşça filtre kağıdına yerleştirin. Farenin muhafaza kafesinden kayıt kafesine transferinin minimum stresle gerçekleştiğinden emin olun.
Fare kayıt kafesinin içine girdikten sonra, kapağı yerleştirin ve pleksiglas kapak yüzeyindeki doğrudan ortam ışığı yansımalarını en aza indirmek için kapağın üst kısmını emici bir tezgah mavi pediyle örtün. Alt odadaki ultraviyole ışıkları açın. Üst ve alt kameralardan RT-VSA video kaydetmek için, birden fazla web kamerasından veya ağa bağlı kameradan aynı anda kayıt yapmak üzere yapılandırılmış video gözetim kayıt yazılımını kullanın.
Program penceresinde Cmd R tuşuna basarak kaydı başlatın. Saniyede bir kare hızında video kayıtları gerçekleştirin. Kayıtları başlattıktan hemen sonra odadan çıkın ve kapıyı yavaşça kapatın.
Tüm deney boyunca odanın sessiz kaldığından emin olun. Cmd T.Ultraviyole ışıklarını kapatın. Kaydı durdurduktan sonra, yazılım otomatik olarak her kamera için m4v formatında bir film dosyası oluşturur ve daha önce seçilen bir hedef klasörde kameranın adı altında kaydeder.
Her fotoğraf makinesinin klasöründe deneylerin tarihe göre klasörler halinde düzenlendiğini doğrulayın. Her tarih veya deneme klasöründe, bir m4v dosyası ve her film karesine karşılık gelen tek tek jpeg dosyalarının tümü olduğunu doğrulayın. Masaüstünde denemenin adı ve tarihi ile bir klasör oluşturun ve m4v dosyalarını bu klasöre aktarın.
Film klasörünü harici bir bilgisayarda analiz etmek üzere bir flash sürücüye kopyalayın. Işık fazı sırasında alt kamera veya karanlık faz sırasında üst kamera tarafından toplanan bir film dosyasını analiz için açın. Filmin kalitesini değerlendirdikten sonra, ileri sarma komutunu veya zaman çubuğu kaydırıcısını kullanarak doğru zaman penceresine geçerek denemeleri analiz edin.
Işık fazı sırasında işeme aktivitesi 11:00 ile 5:00 PM arasında ve karanlık faz sırasında gece yarısı ile 06:00 arasında kaydedilir. Hızlı ileri sarma simgesine tıklayarak filmi ileri sarma modunda oynatın veya farenin işediğine dair kanıt arayarak film arasında manuel olarak gezinin. Filtre kağıdında parlak idrar lekelerinin aniden ortaya çıkmasına veya kafesin köşelerine hareket ve fare işediğinde kısa bir hareketsizlik süresi de dahil olmak üzere davranış değişikliklerine bakın. Her boşluğun oluştuğu zamanı kaydedin.
Bir kural olarak, boşluğun zamanı, idrarın tespit edildiği ilk işarette kaydedilir. Boşluğun ölçümlerini almak için, önce idrar noktasının maksimum difüzyonunun meydana geldiği noktayı arayarak zaman içinde ileri veya geri hareket etmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Bu noktada filmi duraklatın ve ekran görüntüsündeki ilgi çekici noktayı işaretlemek için bilgisayar fare okunu analiz altındaki noktaya yerleştirin.
Filmdeki görünüm sırasını hesaba katmak için ekran görüntüsü dosyasını bağıntılı sayılar kullanarak adlandırın. Tüm boşluk noktaları analiz edildikten sonra, bir ekran görüntüsü yakalayarak ve filtre kağıdının kenarlığını tanımlayarak filtre kağıdının toplam alanını ölçün. İdrar lekelerinin her birinin yüzde alanını hesaplayın.
Kalibrasyon eğrilerini ve grafik yazılımındaki interpolat işlevini kullanarak yüzde alanının değerlerini her boşluk noktası için idrar hacmine dönüştürün. Dişi ve erkek Piezo1, 2, nakavt ve kontrol farelerinin işeme davranışı, günün karanlık ve aydınlık fazında kaydedildi. Aktif olmayan ışık fazları sırasında, dişi veya erkek nakavt fareler için analiz edilen herhangi bir parametrede kontrole kıyasla anlamlı bir fark gözlenmemiştir.
Bununla birlikte, aktif karanlık fazda, dişi ve erkek nakavt fareleri, küçük boşluk noktalarının sayısında ve toplam hacminde önemli bir artış ile karakterize edilen, değişmiş işeme fenotipi göstermiştir. Dişi veya erkek nakavt farelerde birincil boşluk lekeleri veya PVS sayısı, PVS başına ortalama hacim veya toplam PVS hacminde kontrol farelerine kıyasla anlamlı bir fark yoktu. Dişi farelerin işeme davranışı bazal koşullar altında ve siklofosfamid tedavisini takiben test edildi.
Bazal koşullarla karşılaştırıldığında, siklofosfamid tedavisinden sonra boşluk başına idrar salınım miktarı daha küçüktür ve miksiyon olayları çok daha sıktır. Tahlil tekrarlanabilirliği için kilit bir husus, hayvanları mümkün olduğunca nazikçe manipüle etmek ve tüm test süresi boyunca minimum stres altında tutmaktır. Bu noninvaziv bir tahlil olduğundan, daha sonra sırasıyla mesane ve eksternal üretra sfinkter fonksiyonlarını değerlendirmek için sitometri ve elektromiyografi dahil olmak üzere ek prosedürler gerçekleştirilebilir.
Bu tekniğin uygulanması, araştırmacıların sağlık ve hastalık durumlarında işeme davranışına belirli yolların katkısını tanımlamasına izin verecektir.
