Bu protokoller, bağışıklık hücrelerinin kanserdeki rollerini aydınlatmak için tek hücre çözünürlüğü miktarı, belirteç birlikte ekspresyonu ve formalin sabit ve parafin gömülü ve taze dondurulmuş doku örnekleri kullanılarak özel bir analiz sağlar. Bu teknik, tek bir doku kesitinde 40 işaretleyicinin eşzamanlı karakterizasyonunu kolaylaştıran, örneklerdeki dokunun yapısını geniş ölçüde koruyan güçlü bir araçtır. Kritik adım antikor optimizasyonu ve doğrulamasıdır.
Adımın tamamlanmaması, yüksek kaliteli tekrarlanabilir verilerin ve sonuçların korunmasını tehlikeye atabilecek düşük kaliteli görüntülere neden olabilir. Tüm antikor içeren tüpleri beş dakika boyunca 10.000 x G'de döndürerek başlayın, bloke edici tampona bireysel antikorlar ekleyin ve iyice karıştırın. Pipetleme yaparken antikor tüpünün tabanını rahatsız etmeyin.
Antikor panelini, 100 mikrolitre bloke tamponu olan 0,1 mikrometrelik santrifüj filtre cihazını önceden ıslatarak filtreleyin. Filtreyi iki dakika boyunca 10.000 x G'de döndürün ve engelleyici tampon akışını bir pipetle çıkarın. Ardından antikor panelini bir spin kolonuna aktarın ve filtreyi iki dakika boyunca 10.000 x G'de döndürün.
Döndürme kolonunu atın ve filtrelenmiş antikor paneli olarak akış akışını kullanın. Antikor boyama için, her bir slaytı kendi tarafına devirerek ve kenarları bir görev sileceğine hafifçe vurarak bloke edici arabelleği slaytlardan çıkarın. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve dokuya 100 ila 200 mikrolitre antikor ana karışımı ekleyin.
Boyama partisine pozitif ve negatif kontrol slaytları ekleyin ve slaytları gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Cihazı kurmak için, kontrol yazılımına giriş yapın ve cihaz uyku modundaysa Uyandır'a tıklayın. Bir slayt yüklemek için Exchange Örneği'ne tıklayın ve ardından kapıyı açmak için Devam'a tıklayın.
Slaytı yükleme yuvasına bir örnek yukarı bakacak şekilde ve etiket sağda olacak şekilde yerleştirin, kapıyı kapatmak için Devam'a tıklayın. Projeyi seçin ve ardından yüklenen örnek için slayt adını seçin. Panoramik görüntüyü slayt optik görüntü bölmesinde görüş alanı veya FOV seçimi için görselleştirin, Mod menüsüne tıklayın ve İkincil Elektron Dedektörü'nü seçin, ardından Görüntüleme Modu menüsüne tıklayın ve QC 300 mikrometreyi seçin.
FOV konumunu kontrol etmek için Jog Stage'e tıklayın ve ardından FOV'un konumunu seçmek ve gezinmek için oklara tıklayın. FOV ekle'ye tıklayın, alan boyutu olarak 400 mikrometreyi 400 mikrometreye ayarlayın ve Görüntüleme Modu olarak İnce'yi ve Bekleme Süresi'nin 1 milisaniyesini seçin, Onayla'ya tıklayın. Bir FOV listesi oluşturduktan sonra, görüntü odağına ilerleyin ve ışını görüntülenmeyecek bir doku bölgesine hareket ettirerek Damgalamayı ayarlayın.
Net bir merkezi görüntü elde edilene kadar parametreleri ayarlayın, Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Elde edilen görüntüler otomatik olarak yüklenecek ve web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında saklanacaktır. Burada gösterilen matris, prob saflığından ve oksitlerden türetilen yüzde çapraz konuşmayı açıklar.
Burada mavi kutular %0,5 çapraz konuşmadan büyük veya buna eşit olduğunu ve açık kutular %0,5'ten az çapraz konuşmayı gösterir. Mass etiketleri için, hiçbir kanala, bir veya iki kanala veya ikiden fazla kanala en az %0,5 çapraz konuşmaya katkıda bulunan problar burada gösterilir. Hiçbir probdan, bir veya iki probdan veya ikiden fazla probdan en az% 0.5 çapraz konuşma alan kütle kanalları da gösterilmiştir.
Burada akciğer adenokarsinomu, neoplastik olmayan böbrek ve bademcik gibi farklı dokulardaki temsili boyama görüntüleri tasvir edilmiştir. Bu teknik kullanılarak boyanmış ve filtreleme ve düzeltmeden önce üçüncü taraf bir dijital görüntü analiz yazılımı programı kullanılarak görselleştirilmiş bir bademcik dokusu kesitinin görüntüsü burada sunulmuştur. Filtreleme ve düzeltme adımlarından sonra aynı koşullar altında aynı bölümün görüntüsü burada gösterilmiştir.
Bu yöntem, doku bölümlendirme, hücre segmentasyonu, işaretleyici birlikte ekspresyonu, komşu analizi ve uzaktan analiz gibi kapsamlı analizlere izin veren üçüncü taraf bir dijital görüntü analiz yazılımına yüklenebilen görüntüler üretir. Araştırma yoluyla yüksek oranda multipleks görüntüleme yöntemleri mevcuttur. Farklı paneller oluşturarak, araştırmacılar kanser, normal, paraneoplastik, enflamatuar ve enfeksiyöz örnekleri araştırabilirler.
