Diese Protokolle ermöglichen die Quantifizierung der Einzelzellauflösung, die Koexpression von Markern und eine spezielle Analyse unter Verwendung von formalinfixierten und paraffineingebetteten und frisch gefrorenen Gewebeproben, um die Rolle von Immunzellen bei Krebs aufzuklären. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die gleichzeitige Charakterisierung eines 40-Markers auf einem einzelnen Gewebeabschnitt erleichtert und die Struktur des Gewebes in den Proben weitgehend bewahrt. Der kritische Schritt ist die Antikörperoptimierung und -validierung.
Wenn der Schritt nicht abgeschlossen wird, kann dies zu Bildern mit geringer Qualität führen, die die Beibehaltung qualitativ hochwertiger, reproduzierbarer Daten und Ergebnisse beeinträchtigen können. Beginnen Sie damit, alle Antikörper-haltigen Röhrchen bei 10.000 x G für fünf Minuten herunterzudrehen, fügen Sie einzelne Antikörper in den Blockierpuffer und mischen Sie gut. Stören Sie den Boden des Antikörperröhrchens nicht, wenn Sie es pipettieren.
Filtern Sie das Antikörperpanel durch Vorbenetzung einer 0,1 Mikrometer Zentrifugalfiltervorrichtung mit 100 Mikrolitern Blockierpuffer. Drehen Sie den Filter bei 10.000 x G für zwei Minuten und entfernen Sie den blockierenden Pufferdurchfluss mit einer Pipette. Dann wird das Antikörperpanel in eine Spinsäule überführt und der Filter bei 10.000 x G zwei Minuten lang gedreht.
Verwerfen Sie die Spin-Säule und verwenden Sie den Durchfluss als gefilterte Antikörperplatte. Entfernen Sie für die Antikörperfärbung den blockierenden Puffer von den Objektträgern, indem Sie jeden Objektträger auf die Seite kippen und die Kanten vorsichtig gegen einen Aufgabenwischer klopfen. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und geben Sie 100 bis 200 Mikroliter Antikörper-Master-Mix in das Gewebe.
Fügen Sie positive und negative Kontrollobjektträger in die Färbecharge und inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 Grad Celsius. Um das Gerät einzurichten, melden Sie sich bei der Steuerungssoftware an und klicken Sie auf Aufwachen, wenn sich das Gerät im Schlafmodus befindet. Klicken Sie auf Exchange-Beispiel, um eine Folie zu laden, und klicken Sie dann auf Weiter, um die Tür zu öffnen.
Legen Sie den Objektträger in den Ladeschlitz mit einer Probe nach oben und dem Etikett auf der rechten Seite, klicken Sie auf Weiter, um die Tür zu schließen. Wählen Sie das Projekt und dann den Foliennamen für das geladene Beispiel aus. Visualisieren Sie das Panoramabild auf dem optischen Diabildbereich für das Sichtfeld oder die FOV-Auswahl, klicken Sie auf das Menü Modus und wählen Sie Sekundärelektronendetektor, klicken Sie dann auf das Menü Bildgebungsmodus und wählen Sie QC 300 Mikrometer.
Klicken Sie auf Jog Stage, um die FOV-Position zu steuern, und klicken Sie dann auf die Pfeile, um zu navigieren und die Position des FOV auszuwählen. Klicken Sie auf FOV hinzufügen, stellen Sie 400 Mikrometer mal 400 Mikrometer als Feldgröße ein und wählen Sie Fein als Bildgebungsmodus und 1 Millisekunde Verweilzeit und klicken Sie auf Bestätigen. Nachdem Sie eine FOV-Liste erstellt haben, fahren Sie mit dem Bildfokus fort und passen Sie die Stigmatisierung an, indem Sie den Strahl in eine Geweberegion bewegen, die nicht abgebildet wird.
Passen Sie die Parameter an, bis ein klares zentrales Bild erhalten wird, klicken Sie auf Start Run. Die aufgenommenen Bilder werden automatisch hochgeladen und in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung gespeichert. Die hier gezeigte Matrix beschreibt den prozentualen Übersprech, der sich aus der Reinheit und den Oxiden der Sonde ergibt.
Hier zeigen blaue Kästchen größer oder gleich 0,5% Übersprechen und klare Felder weniger als 0,5% Übersprechen an. Für die Massen-Tags werden hier Sonden angezeigt, die mindestens 0,5% Übersprechen in keine Kanäle, einen oder zwei Kanäle oder mehr als zwei Kanäle beigetragen haben. Massenkanäle, die mindestens 0,5% Übersprechen von keinen Sonden, einer oder zwei Sonden oder mehr als zwei Sonden erhalten, werden ebenfalls angezeigt.
Die repräsentativen Färbebilder in verschiedenen Geweben wie Lungenadenokarzinom, nicht-neoplastische Niere und Mandeln sind hier dargestellt. Ein Bild eines Mandelgewebeschnitts, der mit dieser Technik gefärbt und vor dem Filtern und Korrigieren mit einem digitalen Bildanalyseprogramm eines Drittanbieters visualisiert wurde, wird hier vorgestellt. Das Bild des gleichen Abschnitts unter den gleichen Bedingungen nach Filter- und Korrekturschritten wird hier angezeigt.
Diese Methode generiert Bilder, die in eine digitale Bildanalysesoftware eines Drittanbieters hochgeladen werden können, was eine umfassende Analyse wie Gewebekompartimentierung, Zellsegmentierung, Marker-Co-Expression sowie Nachbaranalyse und Fernanalyse ermöglicht. Hochmultiplex-Bildgebungsverfahren sind durch Forschung verfügbar. Durch den Aufbau verschiedener Panels können Forscher Krebs-, normale, paraneoplastische, entzündliche und infektiöse Proben untersuchen.
