Protokolümüz, hafif sulu bazlı reaksiyon koşulları altında tek adımlı çapraz bağlama ve kopolimerizasyon tekniğinde 100 nanometre altı protein yüklü nanojellerin sentezlenmesinde önemli bir ilerleme sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, protein yüklü nanojelleri hafif koşullar altında sentezleme, sert organik çözücülerden ve yüksek sıcaklıklardan kaçınma ve böylece biyolojik yükün bütünlüğünü koruma yeteneğidir. Cam eşyaları filtrelenmiş deiyonize su ile yıkayarak başlayın.
Cam eşyaları kurutmak için, çeker ocakın yan tarafında bulunan basınçlı hava çıkışına güvenli bir nozul takın. Şişeyi sıkıca tutun, nozulu içine yerleştirin ve kontrollü bir akış yaymak için basınçlı havayı etkinleştirin. Daha sonra, 10 mililitrelik bir cam şişeyi deiyonize suyla doldurun ve kauçuk bir septum ile kapatın.
Suyun oksijenini gidermek için bir balonu nitrojen gazı ile doldurun ve balona bir iğne takın. Septumun üzerine yerleştirin ve nitrojen akışına izin vermek için kauçuk septumu delin. Ayrıca, tutarlı bir nitrojen akışı sağlamak için şişeye bir çıkış iğnesi takın.
Daha sonra, BSA veya Cy7 etiketli BSA'yı oksijeni alınmış deiyonize suda çözün. Sonra bu çözeltiyi 10 mililitrelik temiz bir cam şişeye ekleyin. Şişeye AETC solüsyonu ekleyin ve başka bir kauçuk septum ile kapatın.
Akrilamid ve oksijeni giderilmiş deiyonize suyu çözün ve bu çözeltiyi şişenin karışımına ekleyin. Daha sonra disülfür çapraz bağlayıcıyı deiyonize suda çözün ve şişedeki karışıma ekleyin. Karışımı 20 dakika boyunca nitrojen gazı ile yıkayın.
Daha sonra, SDS'yi oksijeni alınmış deiyonize suda çözün. Azot gazıyla yıkanmış bir şırınga kullanarak, karışıma sokun. Ardından, reaksiyon karışımına TEMED'i ekleyin.
Karışımın sürekli bir nitrojen gazı akışı altında üç dakika oksijensizleşmesine izin verin. Amonyum persülfatı bir mililitre oksijeni alınmış deiyonize su içinde çözün ve reaksiyon karışımına ekleyin. Daha sonra şişeyi bir nitrojen atmosferi altında kapatın ve karışımı oda sıcaklığında üç saat 30 dakika karıştırın.
Reaksiyonu sonlandırmak için, contayı şişeden çıkarın. Reaksiyon, karışım berrak ve renksiz hale geldiğinde sona erer. Nanojelleri saflaştırmak için, reaksiyon karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj filtre ünitesine ekleyin.
Reaktif olmayan kimyasalları veya kapsüllenmemiş yükü gidermek için üniteyi deiyonize su ve santrifüj ile doldurun. Nanojel numunesini seyreltmek için santrifüj ünitesine iki mililitre deiyonize su ekleyin. Kapsüllenmiş proteinin bozulmasını önlemek için son numuneyi iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.
Analiz için bir küvet veya tek kullanımlık katlanmış bir kılcal hücre alın. Filtreden arındırılmış su ile temizleyin, ardından büyük toz parçacıklarını gidermek için basınçlı hava üfleyin. Daha sonra küveti 50 ila 100 mikrolitre numune ile doldurun ve 750 ila 1.000 mikrolitre filtrelenmiş deiyonize su ile seyreltin.
Küveti DLS cihazına yerleştirmek için, numune bölmesi kapağını açın ve optik pencerelerde parmak izi bırakmamak için küveti üst kenarlarından tutun. Küveti, cihazın optik yolu ile düzgün bir şekilde hizalanmış şekilde yerleştirin. Ardından ortam ışığını engellemek için numune bölmesini kapatın.
DLS makinesindeki ilgili yazılımı kullanarak partikül boyutu ölçümünü başlatın. Ölçümden sonra, Z ortalaması, ortalama PI, dakika başına sayım hızı, zeta potansiyeli ve ilgili grafikler dahil olmak üzere numuneyle ilgili sonuçları seçin. Korelasyon fonksiyonunun, tek tip bir numuneyi gösteren düzgün bir sigmoidal eğri gösterdiğini onaylayın.
Analiz tamamlandıktan sonra, küveti DLS cihazından dikkatlice çıkarın. BSA proteini ile ilişkili zirvenin yoğunluğunda kademeli bir azalma gözlendi, bu da proteinin nanojel yapısı içinde kapsüllendiğini düşündürdü. Cy7 etiketli BSA yüklü nanojellerin fiziksel kimyasal karakterizasyonu, 50 ila 100 nanometrede tek bir tanımlanmış tepe gösterdi.
Bununla birlikte, boş nanojeller tutarsız ve daha büyük boyutlar gösterdi. Kapsüllenmiş Cy7 etiketli BSA'nın %86'ya kadarı 48 saat içinde serbest bırakıldı. Öte yandan, glutatyon eklenmemiş kontrol deneyleri sadece %15 protein salınmasına yol açtı.
Fourier dönüşümü kızılötesi analizi, nanojel sentezi ve glutatyon inkübasyonu sonrası izole edilen BSA'nın, bozulmamış beta dönüşlerini temsil eden 1.662 santimetre ters tepe ile gösterilen yapısını koruduğunu gösterdi. Bununla birlikte, 30 gün boyunca depolanan nanojellerden elde edilen BSA, moleküller arası beta tabaka yapılarının ve protein agregasyonunun göstergesi olan 1.613 santimetre ters bir tepe gösterdi. Dairesel dikroizm, korunmuş alfa sarmal yapısını gösteren doğal BSA gibi değiştirilmemiş spektrumlar gösterdi.
Bununla birlikte, 30 gün sonra izole edilen BSA için karakteristik piklerdeki küçük sapmalar, bir miktar agregasyon önerdi. Sürekli bir nitrojen akışının sürdürülmesi, oksijenin serbest radikal polimerizasyonunu engellemesini önlemek için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, başlatıcı sistem bileşenleri, başarılı bir sentez için hızlı bir şekilde eklenmesini gerektirir.
Bu prosedürden sonra, nanojel boyutlu dağılım, morfoloji ve yük salma kinetiği, fizyolojik indirgeyici ajan glutatyon ile inkübasyon yoluyla DLS, TEM ve redoks duyarlılığı değerlendirmesi yoluyla daha fazla karakterize edilebilir.
